腾冲嗜热菌(T.tengcongensis MB4<'T>)磷酸烯醇式丙酮酸:果糖磷酸基转移酶转运系统(PTS)及下游代谢途径蛋白功能与结构研究

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基团转运是一种复杂的跨膜转运机制,在细菌中执行这种有效能量和物质转运功能的途径主要是磷酸烯醇式丙酮酸:糖磷酸基转移酶转运系统(PTS)。PTS转运系统能够转移磷酸烯醇式丙酮酸上的高能磷酸基团到膜外的六碳糖上,从而实现糖的磷酸化和跨膜转运的“一体化”反应。腾冲嗜热菌是目前唯一拥有PTS系统的嗜热细菌,其全基因组也得到了成功注释。但有关其PTS系统蛋白的研究,特别是酶学和结构方面的研究有待进一步深入。本研究以腾冲嗜热菌PTS转运系统组氨酸相关磷酸基载体蛋白(HPr)以及下游代谢途径中的关键酶:1-磷酸果糖激酶(FruK)和6-磷酸果糖激酶(PFK)为研究对象,进行了酶动力学研究及相关的蛋白结晶和结构解析工作。针对不同来源HPr蛋白二级结构和三级结构的相似性,我们对腾冲嗜热菌的HPr进行了热变性、尿素变性及蛋白晶体结构的解析研究,HPr蛋白在82.5℃以及7.4M尿素条件下,仍可保持稳定的构象。蛋白晶体最高衍射率为2.0A,利用分子置换法进行了结构解析。结果表明,其带电氨基酸含量明显高于其它HPr蛋白,同时其内部排列更为紧凑,疏水核心的表面积要比其它蛋白更大,因而其分子单元更为有序,刚性最大,导致了其耐热性最为显著。FruK及PFK的最适反应温度分别为70℃和80℃,FruK在60℃条件下能稳定保持活性,90℃保温2小时后,残余相对酶活力42.3%,而在100℃条件下保温2小时,酶活力已基本全部丧失;而PFK在70℃条件下保温2小时能稳定保持活性,90℃保温2小时后,残余相对酶活力60%,而在100℃条件下保温1.5小时,酶活力已基本全部丧失。对FruK蛋白进行了天然蛋白及硒代蛋白的结晶,晶体衍射率可达2.8A,但数据质量不佳,需进一步优化;PFK晶体最高衍射率为4.5A。
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