目的筛选地肤子多糖组分的降血糖和免疫活性部位,通过现代分离分析手段明确其结构特征和药效初步机制,探讨地肤子多糖结构与其降血糖和免疫调节作用的关系,研究具有良好药效活性的地肤子多糖成分。方法(1)地肤子多糖提取分离:采用水提醇沉法得到地肤子总多糖,三氯乙酸法除去多糖中的蛋白质,脱蛋白后的多糖经膜分离得到7个不同分子量段的组分,即6kDa、10 kDa、20 kDa、50 kDa、100 kDa和150 kDa分子量段多糖。(2)地肤子不同分子量段粗多糖的降血糖活性筛选:选择四氧嘧啶诱导所致小鼠糖尿病模型,给予不同粗多糖进行干预后,测定其空腹血糖值和血清中胰岛素、血尿素氮、肝糖原含量,对地肤子多糖组分的降血糖活性进行研究并筛选出活性多糖的分子量段。(3)地肤子不同分子量段粗多糖的免疫调节活性筛选:选择小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验,分别测定其吸光度值,对地肤子多糖组分的免疫调节活性进行研究并筛选出活性多糖的分子量段。(4)选择药理实验筛选所得活性多糖,利用DEAECellulose 52柱色谱分离纯化得均一多糖;采用高效凝胶渗透色谱法测定其纯度和分子量;利用高效液相色谱法、高碘酸氧化法、Smith降解法、甲基化、气质联用色谱法、红外光谱法分析各地肤子均一多糖结构特征。结果(1)经水提醇沉,三氯乙酸除蛋白后得到地肤子总多糖(KSP),多糖提取率为12.1%,多糖含量为49.1%,蛋白含量为2.7%。膜分离后得到7段不同分子量的地肤子多糖(>150 kDa、100~150 kDa、50~100 kDa、20~50 kDa、10~20 kDa、6~10 kDa和<6 kDa),分别命名为KSP-1、KSP-2、KSP-3、KSP-4、KSP-5、KSP-6和KSP-7,占地肤子总糖比例分别为4.2%、2.9%、5.2%、28.3%、3.4%、16.1%和39.9%。(2)7组不同分子量地肤子多糖经体内降血糖活性筛选后,得3组降血糖活性较好的地肤子粗多糖,即KSP-4、KSP-6和KSP-7,其中以KSP-7活性为最佳。(3)经体外脾细胞增殖及巨噬细胞吞噬中性红能力的测定筛选出3组免疫调节活性理想的多糖,即KSP-3、KSP-6和KSP-7,其中以KSP-6活性为最佳。(4)选取KSP-6和KSP-7进行DEAECellulose 52柱色谱分离,经分离纯化后得到4个地肤子均一多糖,分别命名为KSP-6a,KSP-6b,KSP-7a和KSP-7b;分子量依次为9.11×103 Da、8.44×103 Da、5.58×103 Da、3.07×103 Da;KSP-6a的单糖组成为Man、GlcA、GalA、Glc、Gal和Xyl,KSP-6b、KSP-7a和KSP-7b均由Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal和Xyl组成,但单糖摩尔比各有差异,进一步采用高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析、气质联用色谱法对其结构进行解析:KSP-6a主链由Xyl和Glc构成,KSP-6b主链由Xyl和Gal构成,KSP-7a主链由Glc和Gal构成,KSP-7b主链由Glc和Rha构成。结论(1)膜分离法适用于地肤子多糖的初步分段,此方法按照不同分子量将多糖进行了分段后,既能够做到初步纯化,也可以为后期深入研究简化过程,提高研究效率。(2)地肤子多糖具有较好的降血糖作用及免疫调节作用。(3)具有最佳免疫调节活性的KSP-6经分离纯化后得到均一多糖KSP-6a和KSP-6b,KSP-6a的单糖组成中以Glc居多,而KSP-6b的单糖组成中则以Man和Glc居多;具有最佳降血糖活性的KSP-7经分离纯化后得到均一多糖KSP-7a和KSP-7b,其单糖组成均以Glc和Gal居多;4个地肤子均一多糖的单糖摩尔比及连接方式各不相同,且单糖组成稍有不同。(4)在4个地肤子均一多糖的不同单糖组成下,以Man和Glc居多时,免疫调节活性好;以Glc和Gal居多时,降血糖活性好。