论文部分内容阅读
目的探讨阴虚动风证帕金森病大鼠黑质纹状体JNK/AP-1信号通路变化及复方地黄颗粒的作用效果和机制。方法实验采用6-羟基多巴胺注射于大鼠右侧黑质两点（前囟后5.2 mm,中线右侧1.0 mm,硬膜下9mm;前囟后5.2mm,中线右侧2.5 mm,硬膜下8.5 mm）,制备阴虚动风证PD大鼠模型。本实验主要分两部分:（一）研究阴虚动风证PD动物模型制备及复方地黄颗粒干预作用。将造模成功大鼠随机分为模型组、复方地黄颗粒1组（1g/kg）、复方地黄颗粒2组（7g/kg）,每组10只。另取正常对照组大鼠10只、假手术组大鼠10只作为对照。其中复方地黄颗粒1组大鼠灌胃1g/kg（0.1g/m L）复方地黄颗粒,复方地黄颗粒2组大鼠灌胃7g/kg（0.7g/m L）复方地黄颗粒,其他组灌胃等量生理盐水。每次灌胃量为1m L/100g,每日1次,连续6周。分别在实验的第2周、4周、6周,进行神经行为学检测;6周时每组7只大鼠取黑质纹状体,3只大鼠灌流固定取整脑。蛋白质印迹法（Western blot）检测TH蛋白表达;免疫组织化学染色（IHC）检测黑质DA神经元形态及数目变化;羟胺法检测氧化应激指标SOD、比色法检测GSH-px、分光光度法检测GSH、TBA法检测MDA的变化;TUNEL法检测黑质区细胞凋亡变化;Western blot检测凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax的变化。（二）观察阴虚动风证PD大鼠JNK/AP-1信号通路变化及复方地黄颗粒干预作用。将造模成功大鼠随机分为模型组、复方地黄颗粒组（7g/kg）、抑制剂组（SP600125）、复方地黄颗粒合抑制剂组,每组10只。另取正常对照组大鼠10只、假手术组大鼠10只。其中复方地黄颗粒组灌胃7g/kg（0.7g/m L）复方地黄颗粒,腹腔注射10%的二甲基亚矾（DMSO）;抑制剂组腹腔注射SP600125溶液（30 mg/Kg）,灌胃等量生理盐水;复方地黄颗粒合抑制剂组大鼠给以灌胃7g/kg（0.7g/m L）复方地黄颗粒,同时腹腔注射SP600125（30mg/Kg）,其他组灌胃等量生理盐水,腹腔注射10%的DMSO。灌胃量为1m L/100g,1次/日;腹腔注射量为0.1 m L/100g,2次/周,连续6周。分别在实验的第2周、4周、6周,进行神经行为学检测;6周时每组7只大鼠取黑质纹状体,3只灌流固定取整脑。TUNEL法检测黑质区凋亡细胞变化;Western blot法检测Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase3、Caspase9、Cyt-c、p53、p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos等蛋白表达;免疫荧光法（IF）检测黑质区Cleaved Caspase3/TH,p-c-Jun/TH细胞表达。结果1阴虚动风证PD模型制备及复方地黄颗粒干预作用（1）行为学变化:阴虚动风证PD模型大鼠呈现易激惹（异常暴躁）状态,旋转快速而剧烈,旋转圈数为（358.00±17.89）;用药干预4周、6周后,复方地黄颗粒1组、复方地黄颗粒2组大鼠的旋转圈数较之模型组明显降低,差异均有统计学意义（P＜0.001）。且复方地黄颗粒2组较之复方地黄颗粒1组在治疗2周、4周、6周时旋转圈数显著降低,有统计学意义（P＜0.001）。（2）TH变化:阴虚动风证PD大鼠TH表达显著降低（P＜0.01）;复方地黄颗粒干预6周后,复方地黄颗粒1组较模型组TH蛋白表达无明显升高,差异无统计学意义（P＞0.05）,而复方地黄颗粒2组较模型组明显升高,差异有统计学意义（P＜0.001）;复方地黄颗粒2组和复方地黄颗粒1组比较,复方地黄颗粒2组TH蛋白表达显著升高,差异有统计学意义（P＜0.001）。免疫组织化学染色亦显示黑质区TH神经元胞体萎缩,轮廓及突起不清晰,TH神经元数目较之正常对照组及假手术组明显减少,差异有统计学意义（P＜0.001）;复方地黄颗粒干预6周以后,复方地黄颗粒2组的TH神经元胞体饱满,轮廓及突起较清晰,TH细胞数目与模型组比较显著增多,差异有统计学意义（P＜0.01）;而且复方地黄颗粒2组和复方地黄颗粒1组比较,差异有统计学意义（P＜0.01）。（3）氧化应激变化:模型组较之正常对照组和假手术组大鼠SOD含量以及GSH、GSH-Px活性均显著降低（P＜0.001）,而MDA水平明显增高（P＜0.001）;复方地黄颗粒2组能显著降低大鼠纹状体MDA水平（P＜0.001）,增加SOD含量以及GSH、GSH-Px活性（P＜0.05）;与复方地黄颗粒1组比较,复方地黄颗粒2组MDA水平显著降低（P＜0.001）,SOD含量以及GSH、GSH-Px活性明显升高（P＜0.05）。（4）细胞凋亡变化:阴虚动风证PD模型大鼠TUNEL阳性细胞数目显著升高,和正常对照组及假手术组比较,有统计学差异（P＜0.001）;复方地黄颗粒干预6周以后,复方地黄颗粒1组和复方地黄颗粒2组均能降低黑质区TUNEL阳性细胞数目,复方地黄颗粒2组黑质区TUNEL阳性细胞数目较模型组明显降低,差异有统计学意义（P＜0.001）;且复方地黄颗粒2组和复方地黄颗粒1组比较,差异有统计学意义（P＜0.01）。在蛋白水平上,阴虚动风证PD模型大鼠Bcl2/Bax表达显著降低（P＜0.001）;干预6周后,复方地黄颗粒1组和复方地黄颗粒2组均能升高Bcl2/Bax蛋白表达。复方地黄颗粒2组纹状体部位Bcl2/Bax蛋白表达较模型组明显升高,差异有统计学意义（P＜0.001）;且复方地黄颗粒2组较之复方地黄颗粒1组Bcl2/Bax蛋白表达显著升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。2阴虚动风证PD大鼠JNK/AP-1信号通路变化及复方地黄颗粒干预作用（1）行为学变化:阴虚动风证PD大鼠经过APO诱导后随即出现异常暴躁状态,易激惹,旋转快速而剧烈,模型大鼠旋转圈数平均可达到356.63r/30min;药物干预4周、6周后检测发现,复方地黄颗粒组（7g/kg）、抑制剂组、复方地黄颗粒合抑制剂组大鼠旋转圈数明显降低（P＜0.001）;且复方地黄颗粒合抑制剂组较之复方地黄颗粒组（7g/kg）大鼠旋转圈数亦显著下降（P＜0.01）。（2）细胞凋亡变化:阴虚动风证PD模型大鼠TUNEL阳性细胞数目显著升高,Cleaved Caspase3阳性细胞及Cleaved Caspase3、Caspase9、Cyt-c、C-myc、p53蛋白表达显著增多,Bcl-2/Bax蛋白表达明显减少。复方地黄颗粒组（7g/kg）、抑制剂组以及复方地黄颗粒合抑制剂组大鼠TUNEL阳性细胞数目、Cleaved Caspase3阳性细胞表达以及Caspase9、Cleaved Caspase3、Cyt-c、C-myc、p53蛋白表达显著降低,Bcl-2/Bax蛋白表达明显升高。复方地黄颗粒合抑制剂组较之复方地黄颗粒组（7g/kg）,黑质区TUNEL阳性细胞表达和Cleaved Caspase3细胞数目减少,Caspase9、Cyt-c、C-myc、p53蛋白表达显著降低,Bcl-2/Bax的表达明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）JNK/AP-1信号通路的变化:阴虚动风证PD模型大鼠p-JNK/JNK、p-cJun/c-Jun蛋白表达以及黑质区p-c-Jun阳性细胞数目、AP-1转录活性均明显升高（P＜0.001）;干预6周以后,复方地黄颗粒组（7g/kg）、抑制剂组、复方地黄颗粒合抑制剂组大鼠黑质区的p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun蛋白表达、p-c-Jun阳性细胞数目以及AP-1转录活性均显著降低;且复方地黄颗粒合抑制剂组较之复方地黄颗粒组,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论（1）阴虚动风证PD大鼠存在处于氧化应激状态,黑质纹状体区发生大量的细胞凋亡。复方地黄颗粒能抑制氧化应激、细胞凋亡。（2）阴虚动风证PD大鼠黑质纹状体区细胞凋亡的发生机制与JNK/AP-1信号通路的激活有关,复方地黄颗粒的治疗作用和抑制JNK/AP-1信号通路的磷酸化相关。