论文部分内容阅读
捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素(Galectin)和半胱氨酸蛋白酶(CysteineProtease)在宿主与寄生虫相互作用过程中起到了重要的作用。基于本实验室以前的研究,本论文主要进行了以下的工作:1.地高辛标记探针的制备根据GenBank发表的山羊IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-1β和TNF-α序列设计引物,以本试验室保存的相关细胞因子为模板,经PCR法合成地高辛标记的探针。琼脂糖凝胶电泳检测探针分子量大小与设计值相符。紫外分光光度法检测上述探针的浓度分别为0.82μg/μL、0.56μg/μL、0.72μg/μgL、0.69μg/μL、0.91μg/μL和0.78μg/μL。斑点杂交显示探针的标记效率高达0.001ng。RT-PCR和山羊外周血淋巴细胞原位杂交法证明地高辛标记的探针具有特异性。2.重组捻转血矛线虫galeetins免疫山羊真胃细胞因子表达定位用重组雌、雄捻转血矛线虫galectins(rHco-GAL-m/f)免疫山羊,通过原位杂交法对阴性对照组(A)、攻虫对照组(B)、免疫攻虫组(C)和免疫非攻虫组(D)山羊真胃中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α进行了定位,并对真胃中上述细胞因子的阳性反应细胞数量做了分析。结果显示:细胞因子mRNA仅在真胃的黏膜下层中转录,表现为有蓝色的反应信号。其中A组山羊真胃组织中无反应信号,其他3组真胃黏膜下层中均有上述细胞因子mRNAs的蓝色反应信号。IL-4和IL-6阳性反应细胞数量在B、C和D组山羊真胃黏膜下层中差异显著(P＜0.05),与B组和D组的阳性反应细胞数相比,C组要明显高于其它两组。IL-1β、IL-2和TNF-α阳性反应细胞数量在B、C和D组山羊真胃黏膜下层中差异显著(P＜0.05),与B组和C组的阳性反应细胞数相比,D组要明显高于其它两组。另外,IFN-γ阳性反应细胞数量在B组和C组之间的差异不显著(P＞0.05),D组与B组和C组之间差异显著(P＜0.05),且明显高于其它两组。以上结果说明rHco-GAL-m/f能够有效诱导山羊真胃局部免疫应答。3.捻转血矛线虫galectins阶段性表达的检测提取捻转血矛线虫第1期幼虫、第2期幼虫、第3期幼虫和雌、雄成虫的天然蛋白,并用Bradford法测蛋白质浓度。分别用兔抗重组捻转血矛线虫雌、雄成虫galectins血清为一抗,通过Western blot法检测galectin在捻转血矛线虫上述生活阶段的表达并定量分析。结果显示,galectin只在雌、雄成虫阶段表达,表现为一条约33kDa的条带,两种一抗均能识别雌、雄成虫galectins。图像分析表明,galectin在雌虫中的杂交条带灰度是雄虫的1.4倍。4.捻转血矛线虫半胱氨酸蛋白酶(Hc58)阶段性表达的检测应用在第三章中制备的捻转血矛线虫第1期幼虫、第2期幼虫、第3期幼虫和雌、雄成虫天然蛋白,用山羊抗重组捻转血矛线虫Hc58血清为一抗,通过Western blot检测Hc58在捻转血矛线虫上述生活阶段的表达并定量分析。结果显示,Hc58只在雌、雄成虫阶段表达,表现为有一条约29kDa的条带,说明Hc58在捻转血矛线虫中是阶段性表达的。图像分析表明,Hc58在雌虫中的杂交条带灰度是雄虫的1.62倍。