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抗坏血酸(AsA)是植物中重要的抗氧化物质,在植物的多个生理过程中发挥着重要的作用。由于人类已经丧失了合成抗坏血酸的能力,必须从饮食中获取,新鲜水果和蔬菜是人类获取抗坏血酸最主要的来源。因而提高植物特别是果蔬中抗坏血酸的含量越来越受到人们的重视。植物抗坏血酸合成途径在1998年才被提出,目前关于植物抗坏血酸合成与代谢的研究十分有限。在番茄中,仅有少数抗坏血酸代谢基因被克隆和鉴定,而通过克隆关键基因调控番茄果实中抗坏血酸合成代谢研究有待深入。本研究从番茄和草莓中克隆抗坏血酸合成相关基因,将其在番茄中超量表达或抑制表达,系统地对相应的转基因材料进行抗坏血酸含量的测定及抗逆性的鉴定,初步鉴定了SlGME1、SlGME2、SlGMP及FaGalUR等基因在番茄抗坏血酸合成代谢中的调控效应；同时利用基因芯片的方法对SlGME1、SlGME2及SlGMP超量表达转基因材料果实进行基因表达谱的分析,进一步挖掘各基因的功能。主要结果如下：1.克隆了番茄抗坏血酸Smirnoff合成途径中的GDP-甘露糖-3’,5’-表型异构酶基因家族中的两个基因SlGMEl和SlGME2, GenBank登录号分别为GQ150164(SlGME1)和GQ150165 (SlGME2);两基因均包含6个外显子和5个内含子,ORF均为113lbp,编码376个氨基酸,核酸水平的一致性为79%,氨基酸水平的相似性为92%；克隆了草莓抗坏血酸半乳糖醛酸合成途径中的关键基因FaGalUR。2.构建了SlGME1、SlGME2与GFP的融合表达载体,利用基因枪微弹轰击的方法使其在洋葱表皮细胞中表达,荧光信号结果结果表明SlGME1及SlGME2均定位于细胞质中。3. SlGME1、SlGME2及SlGMP的组织表达分析结果表明,SlGME1、SlGME2与SlGMP在番茄根、茎、叶、花和果实中均呈组成型表达,但不同组织间表达水平存在差异。4.构建了SlGME1、SlGME2及FaGalUR的正义(超量)表达转化载体,利用农杆菌介导的遗传转化方法将它们转入番茄常规品系Ailsa Craig中,同时还转化了SlGMP正义及干涉(RNAi)转化载体。获得的番茄转化植株经PCR和Southern杂交检测,结果表明外源基因已插入番茄基因组中,有1-3个拷贝数。5.利用RT-PCR及Real-time RT-PCR检测了部分转基因植株中目标基因的表达情况,结果表明超量表达株系中目标基因表达量显著提高,SlGMP干涉转基因株系中目标基因表达被显著抑制；同时在SlGME2正义转基因株系中发现了转基因共抑制的现象,且对SlGME1的抑制效应更明显。6.应用HPLC对转基因株系叶片及果实中抗坏血酸的含量进行了测定,结果表明,在番茄中提高SlGME1和SlGME2的表达均可显著提高番茄中抗坏血酸的含量,而在SlGME2共抑制转基因材料中,叶片及破色期果实抗坏血酸含量极显著降低,分别仅为对照的12%和28%。同时,超量和抑制番茄中SlGMEs的表达之后,对抗坏血酸合成其他相关基因的表达也产生了较大的影响。上述结果表明两个SlGMEs基因在番茄抗坏血酸合成中均具有重要功能,通过转基因途径可调控抗坏血酸的合成与积累。7.同样,SlGMP在番茄抗坏血酸合成中作用显著,转基因番茄中改变SlGMP的表达水平之后也显著改变了番茄抗坏血酸的含量。SlGMP超量表达番茄株系的叶片及果实中抗坏血酸含量分别最高比对照提高了22%和60%,且果实中的增强作用更为明显；此外,SlGMP-RNAi株系的叶片及果实中抗坏血酸含量显著降低。8.在番茄中异源表达草莓GalUR基因后显著提高了番茄果实中抗坏血酸的含量,最高比对照提高了65%。说明在番茄中可利用GalUR基因来增加抗坏血酸的含量,同时也从侧面揭示了番茄中可能存在抗坏血酸合成的半乳糖醛酸途径。9.抑制SlGMEs和SlGMP的表达,对番茄植株的生长发育产生了显著的影响。SlGME2共抑制转基因番茄株系在幼苗期表现出顶芽生长受抑制、腋芽提早形成的现象,细胞学观察表明主茎顶端分生组织中存在细胞凋亡；SlGMP干涉转基因番茄株系从幼苗阶段就出现叶片自发形成褐斑的现象,研究表明叶片中高浓度H202的积累是形成褐斑的主要原因。10.增加抗坏血酸含量增强了番茄植株对各种非生物逆境的抗性。超量表达SlGME1和SlGME2的转基因番茄植株提高了对氧化、冷害和高盐的抗性,提高番茄中SIGMP的表达增强了转基因番茄植株对氧化逆境的抗性,异源表达草莓GalUR基因的转基因番茄植株也可提高对盐逆境的抗性。11.利用基因芯片杂交,分析了SlGME1超量表达转基因番茄破色期果实中基因表达谱,结果表明转基因番茄中抗逆、脂代谢、类黄酮代谢相关基因显著上调表达。多个差异表达基因共同存在于SlGME1和SlGME2超量表达番茄破色期果实中,且绝大部分变化趋势一致。同样,在SlGMP超量表达转基因番茄破色及红熟期果实中,参与细胞结构、脂代谢、乙烯合成和逆境响应的基因显著上调表达。综上所述,番茄抗坏血酸合成以Smirnoff途径为主要合成途径,SlGMEs与SlGMP是抗坏血酸合成Smirnoff途径中调控番茄抗坏血酸含量的关键基因。同时,番茄中可能存在抗坏血酸合成的半乳糖醛酸途径。