超氧化物歧化酶是一种能够催化超氧化物阴离子自由基（O^-₂）发生歧化反应,生成氧气和过氧化氢,从而清除O^-₂的金属酶,它广泛的存在于生物体内。目前已从细菌、藻类、霉菌、植物、昆虫、鱼类、鸟类和动物中分离得到SOD。并广泛的应用到化妆品、医药、食品添加剂及许多疾病的检测方面。但大多数都是从动物血液中分离纯化的,因为动物体内SOD含量多,活性高,相对来说免疫原性小。 黄鳝是我国重要的淡水鱼类。广泛分布于全国各地。黄鳝营养丰富,肉质鲜美,富含很多对人身体有益氨基酸,以及独特的药用价值,深受国内外消费者青睐。可以说黄鳝具有很大的经济价值。过去关于其形态学、繁殖习性和生态学有着广泛的研究。但对黄鳝超氧化物歧化酶的研究尚未有报道,本文主要对黄鳝超氧化物歧化酶进行分离纯化与性质进行研究,以及一些修饰剂对酶活性的影响,为黄鳝SOD的开发利用奠定基础。 1.分离纯化 将黄鳝肝脏洗净,加入Tris-HCl缓冲液进行组织捣碎抽提SOD,高速离心取上清。将上清液加入正丁醇脱脂、离心;将上清用丙酮分级沉淀,然后再将沉淀用双蒸水溶解,在60℃水浴中加热20min,离心去除部分杂蛋白,获得粗酶液。将粗酶液上DEAE-琼脂糖柱层析,得到一个活力峰,收集、透析、干燥浓缩;再上Sephacryl S-200凝胶柱层析,收集、透析、干燥浓缩得到SOD纯品。然后在将SOD纯品进行等电聚焦和SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。酶的最终提纯倍数为368.5,比活力为1500u/mg,回收率为24.7%。 2.性质研究 通过敏感性试验,10mmol/LKCN对酶的活性没有影响,而当加入50μl 100mmol/L H₂O₂时,酶的活力丧失52%。再测得酶的紫外吸收峰在280nm处,从而可以确定黄鳝肝脏SOD为Fe-SOD;凝胶过滤法测得黄鳝肝脏SOD的分子量为85 000 D,再通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得黄鳝肝脏SOD的亚基分子量为16 500 D。等电聚焦电泳测得黄鳝肝脏SOD的等电点为7.15。 黄鳝SOD具有很高的热稳定性,同时,有广泛的pH范围,对酸碱稳定。但抗胃蛋白酶