缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)是人体内不能合成,只能从食物中获取的必需氨基酸。因α-碳上含有分支脂肪烃链被称为支链氨基酸(BCAAs)。支链氨基酸在植物中的合成途径研究的已经比较清楚,但是BCAAs生理功能及调控机制还知之甚少。在本研究中,我们初步探究了支链氨基酸在水稻中的生理功能,并鉴定了一个调控水稻叶片BCAAs含量自然变异的转录因子Osb ZIP18。支链氨基酸转氨酶(BCAT)是BCAAs合成途径中的关键酶,在BCAAs的合成过程中发挥重要作用。同源序列分析显示,水稻有5个BCATs成员Os BCAT1-Os BCAT5。在酵母中异源表达Os BCAT1/2/4/5能够部分恢复酵母突变体BCAAs营养缺陷的表型,表明这4个基因具有BCAT的功能。Os BCAT4和Os BCAT5均定位于叶绿体,超量表达Os BCAT4和Os BCAT5增加根和地上部Val和Ile含量,而敲除Os BCAT4和Os BCAT5显著降低了根中Val和Ile的含量,表明Os BCAT4和Os BCAT5主要负责水稻中Val和Ile的合成。在营养充足的培养条件下,与野生型ZH11相比,osbcat4/osbcat5双突变体植株生长迟缓,表现出主根长变短,不定根数减少的表型。同时osbcat4/osbcat5双突变体植株地上部和根中的矿质元素含量显著高于野生型。在低浓度营养液培养条件下,osbcat4/osbcat5植株的根长、不定根数和矿质元素积累与野生型相比无明显差异。这些结果表明,矿质元素的过量积累可能是导致osbcat4/osbcat5植株根系生长迟缓的主要原因。进一步研究发现,外源添加BCAAs可以缓解osbcat4/osbcat5双突变体植株根系生长被抑制的表型,同时osbcat4/osbcat5双突变体中矿质元素含量恢复到野生型水平,表明Os BCAT4和Os BCAT5至少可以通过影响根中矿质元素的积累来调控根系发育。此外,我们发现外源添加Ile抑制了水稻主根的伸长,而外源添加Val在减少水稻主根长度的同时增加了不定根的数目,揭示了BCAAs(Val和Ile)在调控根系发育过程中具有相同和独特的生物学功能。综上所述,这些结果表明Os BCAT4和Os BCAT5调控支链氨基酸的动态平衡以及矿质物质的积累,这在水稻根系发育中起着重要的作用。我们对本实验室520份具有广泛遗传多样性的水稻种质资源材料剑叶中的BCAAs含量进行测定,发现这些材料叶片中BCAAs的含量存在非常大的变异。其中,籼稻和粳稻叶片中BCAAs的含量存在显著差异,粳稻中BCAAs的含量显著高于籼稻。利用代谢物全基因关联系分析(m GWAS)我们鉴定到一个影响叶片中BCAAs积累的转录因子Osb ZIP18。Osb ZIP18主要在叶片中表达,亚细胞定位在细胞核。敲除Osb ZIP18基因能够显著降低水稻叶片中的BCAAs含量。EMSA实验和LUC实验结果显示Osb ZIP18能够直接结合到Os BCAT1和Os BCAT2基因的启动子上,激活Os BCAT1和Os BCAT2的表达水平。我们构建了Os BCAT1的CRISPR材料,与野生型相比,Os BCAT1 CRISPR突变体叶片中Leu含量明显降低,暗示Os BCAT1参与BCAAs的合成。这些结果表明Osb ZIP18通过激活BCAAs合成基因的表达来调控水稻叶片BCAAs的积累。Osb ZIP18等位基因的自然变异分析显示,Osb ZIP18启动子区域的一个SNP位点与BCAAs含量有很高的相关性;q RT-PCR结果显示群体中Osb ZIP18基因的表达量与BCAAs的含量呈明显正相关,且籼稻基因型表达量高于粳稻基因型。BCAAs含量的自然变异可能是由Osb ZIP18启动子多态性导致其转录水平变化造成的。低氮胁迫(初期)能够显著诱导Osb ZIP18、Os BCAT1和Os BCAT2的表达,且伴随着这些基因表达量的增加,水稻叶片BCAAs的含量也明显增加。然而,在低氮条件下,Osb ZIP18 CRISPR突变体中Os BCAT1和Os BCAT2的表达量和BCAAs的含量与野生型相比没有明显差异。这些结果表明N饥饿诱导BCAAs的积累主要依赖于Osb ZIP18。综上所述,我们初步探究了水稻支链氨基酸转移酶Os BCAT4和Os BCAT5的生物学功能和水稻叶片BCAAs自然变异的遗传基础。我们利用GWAS鉴定到一个影响水稻叶片BCAAs含量的转录因子Osb ZIP18,并探究了Osb ZIP18调控水稻BCAAs积累的分子机制。