【摘 要】
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本文通过天然产物分离手段对黑曲霉(Aspergillus niger)xj孢子粉进行次级代谢产物分离,得到五种化合物单体ANS 1-5。通过拮抗活性筛选,ANS-4对青枯雷尔式菌Q11-2(以下简称Q11-2)和胡萝卜软腐欧文式菌EC-1(以下简称EC-1)具有显著的拮抗活性,并对其拮抗机制进行了初步研究,主要实验结论如下:1、使用95%的乙醇对20 kg黑曲霉孢子粉进行回流提取,经过减压浓缩共得
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本文通过天然产物分离手段对黑曲霉（Aspergillus niger）xj孢子粉进行次级代谢产物分离,得到五种化合物单体ANS 1-5。通过拮抗活性筛选,ANS-4对青枯雷尔式菌Q11-2（以下简称Q11-2）和胡萝卜软腐欧文式菌EC-1（以下简称EC-1）具有显著的拮抗活性,并对其拮抗机制进行了初步研究,主要实验结论如下:1、使用95%的乙醇对20 kg黑曲霉孢子粉进行回流提取,经过减压浓缩共得到黑曲霉孢子粉浸膏1345 g,得率为6.7%。经过石油醚和乙酸乙酯的分别萃取后对三个部分的抗活性进行筛选,拮抗活性大小:石油醚段>乙酸乙酯段>水部分,石油醚部分对青枯雷尔式菌Q11-2、胡萝卜软腐欧文式菌EC-1和根癌农杆菌T-37三种指示菌的拮抗活性最佳,拮抗活性分别达到83.26%±3.62%、92.15%±2.14%、84.45%±3.15%。2、对石油醚段A1-A11采用色谱柱层析法、Sephadex LH-20凝胶柱分离法、减压色谱柱层析法和重结晶法等方法继续进行细分,得到五个化合物单体,命名为ANS-1至ANS-5,通过核磁共振1H-NMR、13C-NMR和EI-MS质谱对化合物单体进行鉴定,确定五种单体分别是:麦角甾醇（ANS-1）、β-谷甾醇（ANS-2）、5-十五烷基间苯二酚（ANS-3）、5-羟甲基-呋喃甲酸（ANS-4）、丁二酰亚胺（ANS-5）,其中ANS-3、ANS-4、ANS-5为首次从黑曲霉中分离。3、化合物单体ANS 1-5经拮抗活性筛选,结果显示:ANS-4对Q11-2和EC-1的拮抗活性最强,分别为:94.26±1.92%、96.31±2.83%、19.18±4.51%,故选择ANS-4进行对Q11-2和EC-1的拮抗活性的机制初探;化合物ANS-4对Q11-2和EC-1的EC50分别为:0.5611 mg/m L、0.5605 mg/m L。对Q11-2和EC-1的细胞渗透性和完整性实验结果显示:在EC50浓度下,ANS-4对Q11-2的细胞渗透性有一定影响,使Q11-2的胞外电导率上升,而对EC-1的细胞渗透性影响不显著。对Q11-2和EC-1的核酸和蛋白测定则显示没有造成大量的胞内物质外泄例如蛋白质和核酸,而通过扫描电子显微镜对Q11-2和EC-1的细胞形态进行观测的结果说明ANS-4对菌体细胞膜并未造成严重影响,只是造成细胞表面的部分畸形和膨大。通过对两种菌体总蛋白含量的测定,显示出菌体受到ANS-4的影响导致其正常生长代谢功能受到影响,蛋白质的表达量明显下降。对胞内ROS含量变化测定结果显示ANS-4在短时间内迅速打破胞内活性氧族正常水平使其异常积累。另外ANS-4对Q11-2和EC-1的胞外多糖造成影响,使其胞外多糖的含量明显下降,结合生物膜含量测定结果,ANS-4明显抑制了Q11-2和EC-1的生物膜形成,Q11-2和EC-1的泳动能力同样受到ANS-4的抑制,ANS-4通过菌体抑制胞外多糖和生物膜等结构的功能,进而影响菌体的泳动能力。琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的酶活测定显示ANS-4对菌体的这两种三羧酸关键酶酶活具有明显的影响。
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