虹鳟(Oncorhynchus mykiss)属于典型的冷水性鱼类,对高温耐受性很差。随着全球气候的变暖的趋势日趋严峻,夏季高温已成为虹鳟养殖环节中最大的威胁,尤其是在水库网箱等集约化养殖模式下,高温引起的热应激严重制约虹鳟的养殖生产。因此,深入理解虹鳟热应激反应的分子机制,对于虹鳟热适应生物学研究具有重要理论意义,对于优化虹鳟夏季集约化养殖的现场管理也有生产实践指导作用。然而,目前有关虹鳟热应激响应的分子机制尚不清楚。本研究以遗传背景一致的虹鳟为试验材料,先后对其进行了急性(以2.5℃/h的速度将水温从18℃快速升至25℃)和慢性(以1℃/d的速度将水温从18℃缓慢而均匀地升至25℃)热应激处理,然后采用定量蛋白质组学和代谢组学方法系统分析了虹鳟肝脏蛋白质和小分子代谢物的种类和丰度变化情况,并利用生物信息学方法对差异分子所涉及的代谢通路进行了分析,此外还对慢性热应激条件下的蛋白质组和代谢组学数据进行了初步的关联分析。主要研究结果如下:1.虹鳟肝脏响应急性热应激的蛋白质组学研究:基于非标记定量(Label-free)蛋白质组学技术,对虹鳟急性热应激前后肝脏蛋白质组表达差异进行了分析,共鉴定肽段数16746个,蛋白质3362个。通过相对定量值差异倍数和显著性分析,共鉴定得到152个差异表达蛋白(p-value<0.05)。其中,表达上调42个,下调38个,仅在对照组中表达35个,仅在热应激组表达37个。对其进行GO(Gene Ontology,基因本体论)注释及富集分析,结果表明差异表达蛋白主要来自于细胞核、细胞外基质及细胞质,以结合、桥接、酶促反映活性等功能为主。以KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书)通路为单位,以所有鉴定到的蛋白质为背景,通过Fisher精确检验,最终确定包括HSP 70、HSP 90α、ApoB-100、ApoA-1、C3、BF、纤维蛋白原等在内的58个差异表达蛋白,显著地被富集到了雌激素信号通路、脂肪消化和吸收、补体和凝血级联反应以及血小板激活等12条代谢/信号通路。2.虹鳟肝脏响应慢性热应激的蛋白质组学研究:利用DIA定量蛋白质组学技术,对虹鳟慢性热应激前后肝脏蛋白质组表达差异进行了分析,共鉴定肽段数67028个,蛋白质12196个。通过相对定量值差异倍数和显著性检验,共鉴定得到390个差异表达蛋白(p-value<0.05),其中热应激后上调表达的蛋白有175个,下调215个。GO功能注释及富集分析结果显示,差异表达蛋白主要位于细胞器被膜和胞外区域,主要参与细胞脂肪酸和脂质代谢等生物学过程。其中HSP70、HSPA4、HSPA5(GRP78/BiP)、HSPA12A、HSPA13、HSP90α、DNAJB1、DNAJC3、HSP30等蛋白的表达水平表达均显著上高。ACOX1、ACOX3、FADS2、SCP2等参与脂质代谢、脂肪酸代谢、羧酸代谢等生物学过程的蛋白表达水平则显著下调。对表达具有显著差异的目标蛋白进行KEGG注释及富集分析,发现它们与蛋白质内质网加工、内质网相关的蛋白质降解(ERAD)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)等20条信号通路显著相关。3.虹鳟肝脏响应慢性热应激的代谢组学研究:采用UHPLC-Q-TOF-MS的非靶向代谢组学技术,对虹鳟慢性热应激前后肝脏代谢物组成和丰度进行了分析。根据正交偏最小二乘法判别分析模型(OPLS-DA)计算得到代谢物的变量权重值(VIP),以VIP>1和p-value<0.05作为差异代谢物筛选标准,在慢性热应激虹鳟肝脏组织中共鉴定到152个差异代谢物,其中,热应激后表达上调的有80个,表达下调的有72个。对差异代谢物进行了的KEGG注释和富集分析,结果显示脯氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、丝氨酸、天冬氨酸盐、3-磷酸丝氨酸等代谢物分子显著富集到了与氨酰-tRNA生物合成、蛋白质组消化与吸收、氨基酸代谢等相关的通路。此外,包括甘油磷脂代谢、不饱和脂肪酸生物合成、亚油酸代谢通路在内的脂质代谢相关通路也被棕榈酸、油酸、亚油酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等差异代谢物显著富集。4.虹鳟肝脏响应慢性热应激的蛋白质组学与代谢组学数据关联分析:通过计算差异表达蛋白与差异代谢物丰度的Pearson相关系数以及寻找蛋白质组和代谢组研究视野下共同的KEGG通路两个手段,对慢性热应激研究中(前述摘要2与3)的组学数据进行了整合分析。最终发现虹鳟肝脏中亚油酸、γ-亚麻酸、二十碳五烯酸、棕榈油酸、棕榈酸、油酸等代谢物分子在慢性热应激条件下其丰度发生了显著上调。共有通路研究表明,不饱和脂肪酸合成、α-亚麻酸代谢和脂肪酸降解及初级胆汁酸生物合成等通路在两类组学研究中均被显著富集。以上结果提示,急性热应激对机体免疫机能产生不利影响,影响虹鳟肝脏脂肪代谢吸收从而导致肝脏功能受损;虹鳟的急性热应反应可能伴随着雌激素表达调控!对慢性热应激条件下虹鳟肝脏蛋白质合成能力下降,机体可能通过内质网应激介导虹鳟肝脏损伤,并会对其脂质代谢产生显著影响。此外,长期高温刺激下,虹鳟体内能量的供给倾向于依赖氨基酸,而非葡萄糖和脂肪酸。虹鳟肝脏中亚油酸、γ-亚麻酸、二十碳五烯酸、棕榈油酸、棕榈酸、油酸等代谢物分子可望作为虹鳟慢性热应激的标志代谢物。本研究为系统解析虹鳟热应激响应的相关分子调控机制,进而为今后耐高温虹鳟遗传改良和新品系选育奠定了良好的科学基础,也为生产实践中虹鳟热应激早期预警和热应激缓解技术的开发提供了理论依据。