心房颤动(Atrial Fibrillation，AF)简称房颤，是临床上较为常见的心律失常之一，往往同多种心血管疾病伴发，也是心脏手术后常见的并发症，房颤会引起心力衰竭、产生慢速或快速的心律失常、也可引起中风、增加风心病的死亡率等。随着我国人口的老龄化加剧，心房颤动的发生率也随之增加。心房颤动的患者会出现不同程度的症状，快速的心脏节律将会引发心前区不适、心悸、头晕等症状，心室充盈不完全，导致心排量降低，出现呼吸困难、水肿等，对患者的生活质量造成了极大的影响。目前学者们对心脏手术后房颤的发生、发展和维持了解甚微，因此研究其机制和影响因素对心房颤动的预防和治疗意义重大。
　　在房颤的发生和发展中，心房重构(atrialre modeling，AR)发挥了关键性的作用。心房重构主要包括心房电重构和心房的结构重构。其中左心房内径(Left atrial diameter, LAD)和心房纤维化水平在心房颤动的形成中具有重要的影响。心房组织中的心肌胶原容积分数(Collagen volume fraction,CVF)是临床上心肌纤维化程度的指标之一，表示心脏间质胶原的含量和比例。促纤维化分子可激活心肌成纤维细胞，各种因子相互作用形成正反馈，进而促进心房肌发生纤维化改变。
　　血小板反应蛋白-1(Thrombospondin-1, TSP-1)又称血小板凝血酶致敏蛋白-1，TSP-1促纤维化的特性受到了广泛的关注，其中包括肝纤维化、心脏纤维化和肾纤维化。转化生长因子-β(TGF-β)的功能多样，也是房颤中一种重要的因子。MMP-9(Matrix metalloproteinase-9)是基质金属蛋白酶家族中分子量最大的蛋白酶又被称作明胶酶B，MMP-9是降解胶原的重要因子之一，其在细胞外基质胶原的重构过程中起到了重要的作用，并参与心血管疾病包括心房纤维化的发生和发展过程，且具有重要的影响。因此，我们认为在心房颤动心房纤维化过程中TSP-1/TGF-β/MMP-9起重要的作用。
　　本研究分析了TSP-1,TGF-β和MMP-9与房颤患者的临床参数是否有相关联，并设计了一系列研究，进一步明确影响心房纤维化的因素，及其在房颤中的作用机制。
　　研究目的：
　　1.选择临床上行心脏手术后的患者进行对照研究，检测心脏瓣膜置换术后窦性心律组(SR组)和术后房颤组(AF组)中心房组织中TSP-1,TGF-β和MMP-9表达水平，明确TSP-1,TGF-β和MMP-9和房颤的关系。
　　2.观察左心房内径在SR组和AF组的表达水平，进一步判断左心房内径与房颤发生的关系；同时，对房颤组心房组织中TSP-1,TGF-β和MMP-9的蛋白表达特征进行分析，明确TSP-1,TGF-β和MMP-9与左心房内径的相关关系；
　　3.检测SR组和AF组中心房纤维化标志物胶原I和胶原Ⅲ蛋白的表达水平，明确胶原I和胶原Ⅲ蛋白在AF发生中的作用，进一步确定TSP-1,TGF-β和MMP-9与心房纤维化的关联；
　　4.研究TSP-1,TGF-β和MMP-9与左房内径、左室射血分数(EF值)和CVF的相关性，判断TSP-1,TGF-β和MMP-9与心肌纤维化标志物的关系，以进一步评估TSP-1,TGF-β和MMP-9介导心肌纤维化的调控作用。
　　5.建立合适的动物房颤模型，便于临床基础研究。
　　6.观察房颤模型动物中TSP-1,TGF-β和MMP-9的表达变化，及其与心肌纤维化等指标的相关性，进一步明确TSP-1,TGF-β和MMP-9与房颤的关联，验证动物模型的研究价值。
　　方法：
　　1.应用系统抽样法随机选择接受心脏手术和心电图检查的患者60例，根据患者术后的心律特征分为2组：窦性心律组30例和术后新发房颤的患者组30例；
　　2.术中获取右心耳组织，Masson染色评估两组心房组织的纤维化程度。应用IPP(Image-proplus)v7.2图形解析程序进行胶原总面积的检测。图像总面积除以胶原总面积后计算平均值，得到胶原容积分数(CVF)；
　　3.WesternBlot检测心房组织中TSP-1,TGF-β和MMP-9和胶原Ⅰ、Ⅲ的蛋白表达水平。在干预后的不同时间点提取细胞蛋白样品，采用WesternBlot法检测各个时间梯度心肌成纤维细胞TSP-1,TGF-β和MMP-9蛋白表达水平，用以判断其对房颤患者的影响。重复培养三个批次的细胞，每批次细胞重复试验3三次；
　　4.采用实时酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定心房组织中TSP-1，TGF-β和MMP-9表达水平。检测的浓度梯度依次为25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39(ng/ml)和0(空白)的标准稀释剂，检测TSP-1，TGF-β和MMP-9在不同浓度梯度下TSP-1，TGF-β和MMP-9的表达情况；
　　5.建立、优化以兔为基础的动物遥测房颤模型，记录房颤的遥测数据验证，使模型动物的房颤发生率高，操作简便易行，可重复性强，为进一步的临床基础研究服务。
　　6.模型建立成功后，兔耳采血备TSP-1/TGF-β/MMP-9的ELISA检测，麻醉固定后切取右心房组织进一步Masson染色和Westernblot分析。TSP-1/TGF-β/MMP-9的检测方法同前所述。
　　7.统计学处理：数据统计分析使用SPSS22.0软件。采用均数±标准差(?x±s)表示计量资料数据，两独立样本间采用t检验进行组间比较，独立危险因素分析采用单因素与多因素logistic回归分析，P＜0.1的因素被纳入多因素logistic回归分析中。在各项统计分析中，P＜0.05被认为具有显著差异。
　　结果：
　　房颤患者与窦性节律患者的左心室舒张末期和收缩末期的内径相比均略偏高，但这种差异较小，不具有统计学意义。AF组患者的左心房内经明显大于SR组患者。SR组患者血清中TSP-1含量约为180ng/ml，AF组患者血清TSP-1含量约为230ng/ml(p＜0.05)；同理，对比TGF-β和MMP-9含量，SR组患者血清TGF-β约为28ng/ml，AF组患者血清TGF-β约为44ng/ml；SR组患者血清MMP-9约为120ng/ml，AF组患者血清MMP-9约为200ng/ml(p＜0.05)。蛋白免疫印迹技术检测患者右心耳组织中TSP-1,TGF-β和MMP-9的表达水平，与血清中的检测结果一致。与SR组对比，AF组中右心耳组织中TSP-1的表达水平上调了1.5倍(P＜0.05)。与SR组对比，AF组中TGF-β的表达水平也发生了显著性的上调(P＜0.05)；与SR组对比，AF组患者右心耳组织中MMP-9表达水平增加(P＜0.05)。
　　与SR组对比，AF组中胶原沉积量增加(P＜0.05)，即窦性心律患者心肌纤维化程度较轻；房颤患者心肌纤维化程度较重。粘附蛋白的表达水平反应了纤维化的程度，蛋白免疫印迹法检测Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原在SR组和AF组的表达情况，结果表明，与SR组相比，AF组中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达均增加(p＜0.05)。
　　TSP-1和MMP-9与左房内径大小呈正相关，两者p值分别为0.0101和0.302，均＜0.05。血清TGF-β与左房内径相关性更强，p值为0.0082。本实验研究了TSP-1、TGF-β和MMP-9与射血分数(EF)是否相关。分别以TSP-1、TGF-β和MMP-9水平为横坐标，EF为纵坐标，结果表明TSP-1、TGF-β和MMP-9与EF值不相关。研究发现TSP-1/TGF-β/MMP-9在调控心肌纤维化的过程中发挥重要的作用。通过相关研究分析，TSP-1与CVF水平呈正相关，p=0.0470，＜0.05；TGF-β和MMP-9也与CVF水平呈正相关，p值分别为：p=0.0430，p=0.0186，均＜0.05。
　　房颤模型建立后，兔血清TSP-1/TGF-β/MMP-9水平相较于对照组和假手术组出血了明显升高，与术后房颤的发生存在关联。Westernblot检测分析模型建立后TSP-1/TGF-β/MMP-9在右心耳中的表达升高，和对照组、假手术组差异均有显著性，但假手术组相对于空白对照组则无明显变化，进一步提示TSP-1/TGF-β/MMP-9在房颤的促进作用。右心耳组织的Masson染色结果显示房颤组中纤维化程度重于假手术组和空白对照组，CVF定量分析及相关性分析结果显示TSP-1/TGF-β/MMP-9的表达变化与CVF呈正相关，模型组兔右心耳中TSP-1/TGF-β/MMP-9的表达升高，将导致纤维化程度加重，引起房颤的发生。
　　结论：
　　本研究通过对TSP-1,TGF-β和MMP-9在窦性心律组和房颤患者组的表达水平分析，发现TSP-1,TGF-β和MMP-9在房颤患者组的表达均上调。我们进一步实验证实了血清TSP-1水平与心房纤维化和LAD呈正相关，这表明TSP-1在房颤患者的心房纤维化中的可能作用。血清MMP-9水平也与LAD和心房纤维化有关。TSP-1,TGF-β和MMP-9均可作为房颤发生的预测因素，这提示TSP-1,TGF-β和MMP-9水平升高可能会促进心房纤维化从而影响房颤的发生和维持。模型测试结果进一步证明了TSP-1,TGF-β和MMP-9在房颤形成和持续中的重要作用，在研究TSP-1,TGF-β和MMP-9是否能作为房颤预防和治疗的靶点这个问题上，依然还要很长的路要走，但我们的工作为进一步研究其作用机制打下了良好的基础，具有较高的临床研究价值。