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肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor 2,MEF2)是MADS-Box的家族成员之一,MEF2是一个多基因家族,由MEF2A,MEF2B,MEF2C和MEF2D组成,这4个转录因子在胚胎发育和成年动物组织中的表达模式既有区别又相互重叠,由于选择性剪接方式不同,会形成不同类型的MEF2蛋白,其中,MEF2A主要促进猪成体后Ⅰ型肌纤维的形成。本研究旨在克隆猪MEF2A基因的可变剪接体并分析不同剪接体的组织分布和发育性表达规律。研究以马身猪和大白猪为试验动物,依据课题组RNA-seq的测序结果,采用RT-PCR结合TA克隆测序的试验方法,鉴定猪不同时期肌肉组织中的MEF2A可变剪接体;用生物信息学方法分析MEF2A可变剪接体的生物学特性;使用qRT-PCR检测猪MEF2A可变剪接体的mRNA在90日龄13个组织中的相对表达量,并进一步检测其在1日龄、90日龄和180日龄腰大肌、股二头肌和背最长肌的表达规律。主要结果如下:(1)首次成功获得了猪MEF2A基因的4个可变剪接体,分别命名为:MEF2A1、MEF2A2、MEFAA 和MEF2A4(GenBank 登录号:KY313741,KY305402,KY313742,KY313743)。MEF2A1的第5～8外显子正常剪接;MEF2A2缺失了第5外显子,第6外显子的5’端多出138nt,第7外显子的3’端多出102nt;MEF2A 缺失了第5外显子,第6外显子的5’端多出138 nt;MEF2A4第7外显子的3’端多出102 nt。MEF2A1与GenBank中猪MEF2A1(GenBank登录号:EF576922.1)的核苷酸序列同源性为99.6%,MEF2A2与GenBank中MEF2A2(GenBank登录号:EF576923.1)的核苷酸序列同源性为99.4%,说明本试验获得的MEF2A3和MEF2A4为新发现的MEF2A可变剪接体。(2)生物信息学分析结果发现,MEF2A1、MEF2A2、MEF2A3和MEF2A4都预测到潜在的磷酸化位点;MEF2A的4个可变剪接体均未检测到蛋白的信号肽序列;亚细胞定位结果显示4个剪接体主要定位于细胞核,在细胞质中也有发现;氨基酸结构域检测结果显示,MEF2A1和MEF2A4包含一个保守结构域HJURP_C,MEF2A2和MEF2A3包含两个保守结构域,HJURP_C和Med13_N;氨基酸同源性和进化树结果显示,猪的4个MEF2A分属于2个亚群,MEF2A1和MEF2A4与GenBank中猪的MEF2A1同属于一个亚群,氨基酸序列同源性高达98.9%,MEF2A2和MEF2A3与GenBank中猪的MEF2A2同属于一个亚群,氨基酸序列同源性分别为98.2%和98.9%。MEF2A的4个可变剪接体不在同一个类群,但都同牛和羊的遗传距离最远。(3)qRT-PCR结果显示,MEF2A的4个可变剪接体在大白猪和马身猪的13个组织中都有表达,MEF2A1主要在大白猪股二头肌中和马身猪小肠中表达;MEF2A2主要在大白猪心肌和马身猪小肠中表达;MEF2A3主要在大白猪腰大肌和马身猪背最长肌中表达;MEF2A4主要在大白猪肝脏和马身猪胰脏中表达。(4)进一步检测MEF2A的4个可变剪接体在腰大肌、股二头肌和背最长肌中的发育性表达,结果发现:在大白猪中,MEF2A1、MEF2A2和MEF2A3在腰大肌的最高表达量出现在180日龄,MEF2A1和MEF2A2在股二头肌和背最长肌的最高表达量出现在90日龄,原因可能是背最长肌和股二头肌的构成主体是酵解型肌纤维,氧化型肌纤维比例随日龄增长比例下降,导致MEF2A基因最高表达量的日龄提前。两品种比较,MEF2A4在1日龄马身猪的腰大肌、股二头肌和背最长肌的表达量显著低于同日龄的大白猪(P<0.05),是因为马身猪的生长速度较大白猪缓慢;MEF2A2在180日龄马身猪的股二头肌和背最长肌中的表达量极显著高于同时期的大白猪(P<0.01),MEF2A3在90日龄马身猪的股二头肌和背最长肌中的表达量极显著高于同时期的大白猪(P<0.01),推测原因是与大白猪相比,马身猪肌纤维直径更细,单位面积密度大,含Ⅰ型肌纤维较多。综上所述,本研究首次获得了猪MEF2A基因的4个可变剪接体,对其进行了时空差异性表达研究,为进一步研究MEF2A基因功能奠定基础。