研究目的:　　肿瘤免疫疗法已逐渐成为治疗恶性肿瘤的一种新型疗法，其中TLR激动剂因其具有强有力的诱发机体免疫应答的潜能，在肿瘤免疫治疗中发挥着重要作用。此外，多个TLR的同时刺激具有诱发多重TLR信号协同作用的潜力，近来在肿瘤免疫治疗中受到格外关注。MBP和HP-NAP分别是来源于微生物的TLR4和 TLR2的激动剂，其免疫调节功能已被证实。在本研究中，通过融合表达TLR2/TLR4激动剂rMBP-NAP，在B16黑色素瘤皮下移植瘤模型中对其抗肿瘤作用及作用机制进行了初步研究，以期在获得新型 TLR2/TLR4激动剂的同时，对同步激活多重TLR通路在肿瘤免疫治疗中的潜力进行初步的探讨。　　方法:　　1.构建原核表达载体pET22b(+)-NAP，诱导表达纯化HP-NAP蛋白，并依据实验室前期方法纯化MBP和rMBP-NAP蛋白，并利用内毒素清除柱去除蛋白中残余的内毒素。　　2.建立B16皮下移植瘤模型，并进行MBP、HP-NAP和rMBP-NAP给药处理，期间监测肿瘤生长状况，绘制肿瘤体积生长曲线。　　3.最后一次给药结束后一天，处死小鼠，称取肿瘤重量，计算肿瘤抑制率， H＆E染色检测肿瘤坏死，CD34免疫组化染色检测肿瘤血管生成。　　4.荧光定量 PCR检测脾细胞中DC成熟相关分子基因表达量，ELISA检测脾细胞分泌IL-12的能力，流式细胞术检测CD11c+ DC的比例，评估TLR激动剂促进脾脏中DC成熟的效果。　　5.流式细胞术检测脾细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞比例，ELISA检测细胞因子IFN-γ和IL-2分泌量，评估TLR激动剂对脾脏中T细胞活化的作用。　　6.荧光定量 PCR检测肿瘤组织中 DC成熟相关分子及 T细胞趋化因子CXCL-9和CXCL-10基因表达量，免疫组化检测肿瘤组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润，ELISA和荧光定量PCR检测肿瘤组织中细胞因子IFN-γ和IL-2表达量，荧光定量PCR检测穿孔素和颗粒酶B基因表达量。评估在肿瘤微环境中TLR激动剂诱导DC的成熟及增强T细胞活化的作用。　　结果:　　1. TLR激动剂MBP、HP-NAP及rMBP-NAP均能显著性抑制B16皮下移植瘤的生长，其抑瘤率分别达到53.07％、47.86%、77.27%，并能够促进肿瘤组织坏死，抑制肿瘤血管生成。其中TLR2/TLR4激动剂rMBP-NAP表现出增强的抗肿瘤效果。　　2.与单一的MBP和HP-NAP相比，TLR2/TLR4激动剂rMBP-NAP能够显著性上调脾脏中DC成熟相关分子如CD40、CD80、CD83、MHC II等的表达，显著性促进细胞因子IL-12的分泌，显著增加脾细胞中CD11c+DC、CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例，促进细胞因子IFN-γ和IL-2的分泌。即rMBP-NAP能够激活脾脏中固有和适应性免疫反应。　　3．与单一的MBP和HP-NAP相比，TLR2/TLR4激动剂rMBP-NAP诱导肿瘤组织中DC的成熟，促进CD4+T细胞和CD8+T细胞在肿瘤微环境中的浸润，促进细胞因子IFN-γ和IL-2分泌，以及效应分子穿孔素、颗粒酶B的表达。　　结论:　　和单一的TLR激动剂MBP和HP-NAP相比，TLR2/TLR4激动剂rMBP-NAP能够发挥出更为显著的抗肿瘤效果，rMBP-NAP能够引起强烈的免疫反应，并促进具有效应功能的免疫细胞在肿瘤微环境中的浸润，诱导细胞因子和效应分子在肿瘤微环境中的表达。