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中国是一个历史悠久的农业大国,水稻作为主要的粮食作物,解决了近14亿人口的温饱问题。低温冷害是一种常见的气象灾害,严重影响了稻作的生产,在东北地区尤其普遍,受到低温冷害的影响较为频繁,多为障碍性冷害,给水稻产量造成巨大损失。障碍性冷害每4-5年就会发生一次较严重的灾害,严重威胁水稻生产。为解决这一矛盾,就需要提高水稻品种的耐冷性。所以我们要克隆耐障碍性冷害基因并利用它培育耐冷品种。本研究前期通过水稻耐寒数字表达谱,筛选出一个与光合作用相关且在低温处理下表达量明显上调的基因,确定耐冷候选基因OsRBCS3为研究对象。本研究对这个基因的CDS区克隆以后,进行序列差异比对,发现L11和K131中二者CDS区没有差别,同时在低温胁迫下发现二者目的基因表达量明显不同,我们便认为该基因的表达量影响了两个品种的耐冷性。它超表达就耐冷。为了证明这个观点,一方面根据实验室现有的OsRBCS3基因过表达材料L-12、L-18品系,利用分子手段筛选其后代阳性株系,验证目的基因超表达以后是否提高了耐冷性;另一方面利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术创造K131中目的基因敲除的品系,验证目的基因沉默表达后耐冷性是否降低。如果假设成立,就说明这个基因表达量增加耐障碍性冷害能力就增加了。主要研究结果如下:1、确定了转基因苗期潮霉素筛选的筛选剂的最佳筛选浓度为15mg/L。利用该浓度筛选T1代株系抗潮霉素的表型,共获得11个株系表型为抗性的幼苗,经过外源基因PCR鉴定,这11个株系中有60个单株为阳性结果,阳性得率为100%。其中材料L-12为6个,每个材料46株共33株,材料L-18为5个,每个材料46株共27株。2、取这11个株系的T0代部分种子,用潮霉素抗性培养基筛选T1代幼苗,不同株系对潮霉素抗性产生不同的分离比,其中,在T1代中10个株系的分离比约为3:1,遵循孟德尔遗传模式。说明外源基因是单拷贝插入,且为单基因显性遗传。也有1株系的分离比低于3:1,不符合孟德尔遗传法则。3、收获这10个株系种子即T2代,每个株系取部分幼苗进行hpt-PCR扩增,检测结果扩增出预期的目的片段大小为472bp,且全部为阳性。筛选出10个阳性过表达株系。分别是L-12为5个株系,L-18为5个株系。4、将OsRBCS3基因从耐冷水稻空育131中克隆出来,利用CRISPR/Cas9技术构建敲除载体,利用根瘤农杆菌介导法遗传转化空育131,获得阳性转基因株系CL为24株,通过分子检测和测序鉴定靶位点发生编辑的突变株系为18株,通过氨基酸序列比对发现,其中5/18株由于靶位点的修饰方式为碱基的插入而引发移码突变,提前产生终止密码子,翻译提前终止。5、对过表达材料和基因敲除材料分别进行进行孕穗期耐冷性指标鉴定,苗期耐冷性指标鉴定和real-time PCR检测,结果表明,利用Gataway技术获得的OsRBCS3基因超表达的转基因株系L-12和L-18的耐冷性和目的基因的表达量较野生型有明显的提高;相反,利用CRISPR/Cas9法编辑的耐冷OsRBCS3基因的突变体CL的耐冷性和目的基因的表达量较野生型有明显的下降。6、对过表达材料、基因敲除材料在低温冷害下进行生理指标的检测,结果显示:过表达植株在低温处理下Rubisco酶活性较野生型有所提高;敲除材料低温处理下Rubisco酶活性较野生型有明显下降。相反,在低温处理下丙二醛的含量,在过表达材料中MDA含量低于野生型材料,敲除材料MDA含量高于野生型材料。