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背景:动物研究证实婴幼儿期反复多次的麻醉药暴露可以引起神经毒性,临床研究也证实幼年期麻醉暴露可以引起青少年期精细运动、灵巧度、处理问题的能力及社交能力明显下降。Tau蛋白磷酸化是多种认知功能障碍的病理性改变,磷酸化的Tau蛋白形成纤维缠结,导致神经认知功能障碍。多项研究已经证明Tau蛋白磷酸化可引起认知功能障碍。七氟烷作为一种常用的婴幼儿麻醉药,近年研究显示幼年期多次接受七氟烷麻醉可以引起远期认知功能缺陷或障碍,其具体机制目前尚不明确。基于本团队前期研究我们推测Tau蛋白磷酸化是新生小鼠多次麻醉引起远期认知功能障碍的重要机制之一。探讨如何预防七氟烷多次麻醉对新生小鼠的远期认知功能的影响及机制,可对临床优化婴幼儿麻醉方案提供理论基础。右美托咪定作为临床上常用的具有高选择性的α2肾上腺素受体激动剂,有多项研究表明其具有神经保护作用,但其是否可以降低七氟烷对发育期神经的毒性作用尚不明确。基于预实验的结果我们推测右美托咪定可减轻七氟烷多次麻醉对新生小鼠远期认知功能的影响,右美托咪定通过激动α2肾上腺素受体降低Tau蛋白磷酸化可能是其可能的机制。本研究分为四个部分,首先探讨七氟烷多次麻醉导致发育期神经损伤的机制是否和Tau蛋白磷酸化有关,然后观察右美托咪定是否抑制七氟烷引起的Tau蛋白磷酸化,从而起到预防七氟烷引起发育期神经毒性的作用,并进一步探讨α2肾上腺素受体在预防七氟烷致发育期神经毒性中的作用及机制。第一部分:七氟烷多次麻醉对新生小鼠远期认知功能的影响及Tau蛋白磷酸化的作用目的:探讨多次七氟烷麻醉是否引起远期认知功能障碍,这种作用的机制是否和七氟烷诱导的Tau蛋白磷酸化有关。方法:动物实验采用新出生的健康的C57BL/6野生型6日龄小鼠,随机分为二组:对照组（Control组）:P6、P9、P12天分别吸入40%氧气2h;七氟烷组（Sevoflurane组）:P6、P9、P12天分别吸入40%氧气及3%七氟烷2h。麻醉结束后,即刻取海马组织,蛋白印记杂交（Western Blot,WB）检测两组小鼠海马组织中Tau蛋白的表达（n=6）,另一部分小鼠待麻醉结束后,将小鼠放回鼠笼继续饲养,在P29-30天进行新物体识别试验,在P31-37天进行水迷宫试验（n=12）。水迷宫试验结束后取海马组织,WB检测两组小鼠海马组织中PSD-95（Postsynaptic density-95）的表达。细胞实验采用HT22细胞系进行实验,也分成2组,对照组（Con）通入40%氧气24h,七氟烷组（Sevo）通入40%氧气及3%的七氟烷24h,用WB检测两组细胞Tau蛋白及其磷酸化的表达。结果:1.WB的结果显示,与对照组相比,七氟烷组增加了海马区Tau蛋白AT8（Tau-PS202 and Tau-PT205）位点磷酸化的表达（P＜0.05）,对Tau-PS262位点及总Tau蛋白的表达没有影响;与对照组相比,七氟烷组降低了远期海马区PSD-95蛋白的表达（P＜0.05）;2.水迷宫结果显示:两组之间的平台逃逸时间没有差异,与对照组相比,七氟烷组穿越平台次数明显减少（P＜0.05）;3.新物体试验结果显示:与对照组相比,七氟烷组辨别新物体的能力明显下降（P＜0.05）。4.细胞实验结果显示:与对照组相比,七氟烷组增加了HT22细胞系Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达（P＜0.05）,对总Tau蛋白的表达没有影响。结论:新生小鼠在P6、P9、P12天接受七氟烷麻醉引起了远期认知功能障碍;其作用和多次七氟烷麻醉引起的海马区Tau蛋白磷酸化有关。第二部分:右美托咪定对七氟烷多次麻醉致新生小鼠远期认知功能障碍及Tau蛋白磷酸化的影响目的:探讨右美托咪定是否能改善新生小鼠多次七氟烷麻醉引起的认知功能障碍,这种作用是否和降低七氟烷引起的Tau蛋白磷酸化有关。方法:动物实验采用新出生的健康的C57BL/6野生型P6的小鼠,随机分为四组:空白对照组（Con+Veh组）:P6、P9、P12天分别吸入40%氧气2h,吸入氧气前30min腹腔注射等量的生理盐水;右美托咪定对照组（Con+Dex组）:P6、P9、P12天分别吸入40%氧气2h,吸入氧气前30min腹腔注射10μg/kg的右美托咪定;七氟烷全麻组（Sevo+Veh组）:P6、P9、P12天分别吸入3%的七氟烷麻醉2h,麻醉前30min,小鼠腹腔注射等量的生理盐水;右美托咪定预处理七氟烷全麻组（Sevo+Dex组）:P6、P9、P12天分别吸入3%的七氟烷麻醉2h,麻醉前30min腹腔注射10μg/kg的右美托咪定,麻醉结束后,即刻取海马组织,WB检测四组小鼠海马组织中Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达（n=6）,另一部分小鼠待麻醉结束后,将这些小鼠放回鼠笼,继续饲养,在P29-30天进行新物体试验,在P31-37天进行水迷宫试验（n=12）。水迷宫试验结束后取海马组织,WB检测四组小鼠海马组织中PSD-95的表达。细胞实验采用HT22细胞系进行实验,也分成4组:对照组（Con）通入40%氧气24h,七氟烷组（Sevo）通入40%氧气及3%的七氟烷24h,右美托咪定组（Dex）培养基加入1μmol的右美托咪定,30min后通入40%的氧气24h,右美托咪定+七氟烷组（Dex+Sevo）培养基加入1μmol的右美托咪定,30min后通入40%氧气及3%的七氟烷24h,用WB检测两组细胞Tau蛋白的表达。结果:动物部分:1.WB结果显示,与对照组相比,Con+Dex组对海马区Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达没有影响（P＞0.05）,Sevo+Veh组增加了海马区Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达（P＜0.05）,与Con+Dex组相比,Sevo+Dex组对Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达没有明显影响,与Sevo+Veh组相比,Sevo+Dex组降低了七氟烷诱导的新生小鼠海马区Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达;与对照组相比,Con+Dex组对远期海马区PSD-95的表达没有影响（P＞0.05）,Sevo+Veh组减少了远期海马区PSD-95的表达（P＜0.05）,与Con+Dex组相比,Sevo+Dex组对远期海马区PSD-95的表达没有明显影响,与Sevo+Veh组相比,Sevo+Dex组减轻了七氟烷引起的远期海马区PSD-95的表达减少;2.水迷宫结果显示:各组之间的平台逃逸时间没有变化。与对照组相比,Con+Dex组穿台次数没有差异（P＞0.05）,Sevo+Veh组穿台次数减少（P＜0.05）,与Con+Dex组相比,Sevo+Dex组穿台次数没有明显变化（P＞0.05）,与Sevo+Veh组相比,Sevo+Dex组穿台次数增加（P＜0.05）;3.新物体试验结果显示:与对照组相比,Con+Dex组辨别新物体的能力没有明显变化（P＞0.05）,Sevo+Veh组辨别新物体的能力明显下降（P＜0.05）,与Con+Dex组相比,Sevo+Dex组辨别新物体的能力没有明显变化（P＞0.05）,与Sevo+Veh组相比,Sevo+Dex组辨别新物体的能力明显增加（P＜0.05）。4.细胞实验结果显示:与对照组相比,Dex组对HT22细胞系Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达没有影响（P＞0.05）,Sevo组增加了HT22细胞系Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达（P＜0.05）,Dex+Sevo组对HT22细胞系Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达没有影响（P＞0.05）,各组对总Tau蛋白的表达没有影响;结论:右美托咪定改善了新生小鼠多次七氟烷麻醉引起的远期认知功能障碍,其作用和右美托咪定减轻七氟烷引起的新生小鼠海马区Tau蛋白磷酸化及远期突触丢失有关。第三部分:α2肾上腺素受体在右美托咪定减轻多次七氟烷麻醉诱导的远期认知功能障碍中的作用目的:探讨右美托咪定是否通过激动α2肾上腺素受体改善新生小鼠多次七氟烷麻醉引起的远期认知功能障碍。方法:采用健康的C57BL/6野生型P6小鼠,随机分为四组:空白对照组（Con+Veh组）:P6、P9、P12天分别吸入40%氧气2h,吸入氧气前40min及30min腹腔注射等量的生理盐水;右美托咪定+育亨宾对照组（Con+Yoh+Dex组）:P6、P9、P12天分别吸入40%氧气2h,吸入氧气前40min腹腔注射1mg/kg的育亨宾及30min腹腔注射10μg/kg的右美托咪定;七氟烷全麻组（Sevo+Veh组）:P6、P9、P12天分别吸入3%的七氟烷麻醉2h,麻醉前40min及30min,小鼠腹腔注射等量的生理盐水;右美托咪定+育亨宾+七氟烷全麻组（Sevo+Yoh+Dex组）:P6、P9、P12天分别吸入3%的七氟烷麻醉2h,麻醉前40min腹腔注射1mg/kg的育亨宾及30min腹腔注射10μg/kg的右美托咪定,麻醉结束后,即刻取海马组织,WB检测四组小鼠海马组织中Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达（n=6）,另一部分小鼠麻醉结束后,将小鼠继续放回鼠笼饲养,在P29-30天进行新物体试验,在P31-37天进行水迷宫试验（n=12）。水迷宫试验结束后取海马组织,WB检测四组小鼠海马组织中PSD-95的表达。结果:1.WB结果显示,与对照组相比,Con+Yoh+Dex组对海马区Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达没有影响（P＞0.05）,Sevo+Veh组增加了新生小鼠海马区Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达（P＜0.05）,与Con+Yoh+Dex组相比,Sevo+Yoh+Dex组增加了新生小鼠海马区Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达（P＜0.05）,与Sevo+Veh组相比,Sevo+Yoh+Dex组对新生小鼠Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达没有影响;与对照组相比,Con+Yoh+Dex组远期海马区PSD-95的表达没有影响（P＞0.05）,Sevo+Veh组远期海马区PSD-95蛋白的表达下降（P＜0.05）,与Con+Yoh+Dex组相比,Sevo+Yoh+Dex组远期海马区PSD-95的表达明显减少（P＜0.05）;与Sevo+Veh组相比,Sevo+Yoh+Dex组远期海马区PSD-95的表达没有影响（P＞0.05）;3.水迷宫结果显示:各组之间的平台逃逸时间没有差异。与对照组相比,Con+Yoh+Dex组穿台次数没有明显差异（P＞0.05）,Sevo+Veh组穿台次数减少（P＜0.05）,与Con+Yoh+Dex组相比,Sevo+Yoh+Dex组穿台次数减少（P＜0.05）,与Sevo+Veh组相比,Sevo+Yoh+Dex组穿台次数没有明显差异（P＞0.05）;4.新物体试验结果显示:与对照组相比,Con+Yoh+Dex组辨别新物体的能力没有明显差异（P＞0.05）,Sevo+Veh组辨别新物体的能力下降（P＜0.05）,与Con+Yoh+Dex组相比,Sevo+Yoh+Dex组辨别新物体的能力下降（P＜0.05）,与Sevo+Veh组相比,Sevo+Yoh+Dex组辨别新物体的能力没有明显差异（P＞0.05）。结论:右美托咪定通过激动α2肾上腺素受体减轻七氟烷引起的新生小鼠海马区Tau蛋白磷酸化,从而改善远期认知功能障碍。第四部分:不同α2肾上腺素受体激动剂在多次七氟烷麻醉诱导远期认知功能障碍中的作用目的:探讨其它α2肾上腺素受体激动剂能否降低新生小鼠多次七氟烷麻醉引起的远期认知功能障碍,进一步确认α2肾上腺素受体是否为预防七氟烷致发育期神经毒性的新靶点。方法:实验一,采用健康的C57BL/6野生型P6小鼠,随机分为四组:空白对照组（Con+Veh组）:P6、P9、P12天分别吸入40%氧气2h,吸入氧气前30min腹腔注射等量的生理盐水;可乐定对照组（Con+Clo组）:P6、P9、P12天分别吸入40%氧气2h,吸入氧气前30min腹腔注射1mg/kg的可乐定;七氟烷全麻组（Sevo+Veh组）:P6、P9、P12天分别吸入3%的七氟烷麻醉2h,麻醉前30min,小鼠腹腔注射等量的生理盐水;可乐定+七氟烷全麻组（Sevo+Clo组）:P6、P9、P12天分别吸入3%的七氟烷麻醉2h,麻醉前30min腹腔注射1mg/kg的可乐定,麻醉结束后,即刻取海马组织,WB检测四组小鼠海马组织中Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达（n=6）,另一部分小鼠待麻醉结束后,将小鼠放回鼠笼继续饲养,在P29-30天进行新物体试验,在P31-37天进行水迷宫试验（n=12）。水迷宫试验结束后取海马组织,WB检测四组小鼠海马组织中PSD-95的表达。实验二:采用健康的C57BL/6野生型P6日龄小鼠,随机分为四组:对照组（Con+Veh组）:P6、P9、P12天分别吸入40%氧气2h,吸入氧气前40min及30min腹腔注射等量的生理盐水;可乐定+育亨宾对照组（Con+Yoh+Clo组）:P6、P9、P12天分别吸入40%氧气2h,吸入氧气前40min腹腔注射注射1mg/kg的育亨宾及30min腹腔注射1mg/kg的可乐定;七氟烷全麻组（Sevo+Veh组）:P6、P9、P12天分别吸入3%的七氟烷麻醉2h,麻醉前40min及30min,小鼠腹腔注射等量的生理盐水;可乐定+育亨宾+七氟烷全麻组（Sevo+Yoh+Clo组）:P6、P9、P12天分别吸入3%的七氟烷麻醉2h,麻醉前40min腹腔注射1mg/kg的育亨宾及30min腹腔注射1mg/kg的可乐定,麻醉结束后,即刻取海马组织,WB检测四组小鼠海马组织中Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达（n=6）,另一部分小鼠麻醉结束后,将小鼠继续放回鼠笼饲养,在P29-30天进行新物体试验,在P31-37天进行水迷宫试验（n=12）。水迷宫试验结束后取海马组织,WB检测四组小鼠海马组织中PSD-95的表达。结果:1.WB结果显示,与对照组相比,Con+Clo组和Con+Yoh+Clo组对新生小鼠海马区Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达没有影响（P＞0.05）,Sevo+Veh组增加了新生小鼠海马区Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达（P＜0.05）,与Con+Clo组相比,Sevo+Clo组对新生小鼠海马区Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达没有影响（P＞0.05）,与Sevo+Veh组相比,Sevo+Clo组降低了新生小鼠海马区Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达（P＜0.05）;与Con+Yoh+Clo组相比,Sevo+Yoh+Clo组增加了新生小鼠海马区Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达（P＜0.05）,与Sevo+Veh组相比,Sevo+Yoh+Clo组对新生小鼠Tau蛋白AT8位点磷酸化的表达没有影响（P＞0.05）;与对照组相比,Con+Clo组和Con+Yoh+Clo组对远期海马区PSD-95的表达没有影响（P＞0.05）,Sevo+Veh组降低了远期海马区PSD-95的表达（P＜0.05）,与Con+Clo组相比,Sevo+Clo组对远期海马区PSD-95的表达没有影响（P＞0.05）,与Sevo+Veh组相比,Sevo+Clo组减轻了七氟烷引起的远期海马区PSD-95的表达减少（P＜0.05）,与Con+Yoh+Clo组相比,Sevo+Yoh+Clo组远期海马区PSD-95的表达明显减少（P＜0.05）;与Sevo+Veh组相比,Sevo+Yoh+Clo组远期海马区PSD-95的表达没有差异（P＞0.05）;3.水迷宫结果显示:各组之间的平台逃逸时间没有变化。与对照组相比,Con+Clo组和Con+Yoh+Clo组穿台次数没有明显差异（P＞0.05）,Sevo+Veh组穿台次数减少（P＜0.05）,与Con+Clo组相比,Sevo+Clo组穿台次数没有明显差异（P＞0.05）,与Sevo+Veh组相比,Sevo+Clo组穿台次数增加（P＜0.05）,与Con+Yoh+Clo组相比,Sevo+Yoh+Clo组穿台次数减少（P＜0.05）,与Sevo+Veh组相比,Sevo+Yoh+Clo组穿台次数没有明显差异（P＞0.05）;4.新物体试验结果显示:与对照组相比,Con+Clo组和Con+Yoh+Clo组辨别新物体的能力没有明显差异（P＞0.05）,Sevo+Veh组辨别新物体的能力下降（P＜0.05）,与Con+Clo组相比,Sevo+Clo组辨别新物体的能力没有明显差异（P＞0.05）,与Sevo+Veh组相比,Sevo+Clo组辨别新物体的能力增加（P＜0.05）,与Con+Yoh+Clo组相比,Sevo+Yoh+Clo组辨别新物体的能力下降（P＜0.05）,与Sevo+Veh组相比,Sevo+Yoh+Clo组辨别新物体的能力没有明显差异（P＞0.05）。结论:不同的α2肾上腺素受体激动剂均可降低新生小鼠多次七氟烷麻醉引起的海马区Tau蛋白磷酸化,从而改善远期认知功能障碍,提示α2肾上腺素受体可能是预防七氟烷致发育期神经毒性的重要靶点。总结论:1.新生小鼠多次七氟烷麻醉可引起远期认知功能障碍,其机制和诱导海马区Tau蛋白磷酸化有关;2.右美托咪定改善了新生小鼠多次七氟烷麻醉引起的远期认知功能障碍,其作用和右美托咪定减轻七氟烷引起的新生小鼠海马区Tau蛋白磷酸化及远期突触丢失有关。3.α2肾上腺素受体参与了七氟烷诱导的新生小鼠海马区Tau蛋白过度磷酸化,右美托咪定和可乐定均可通过激动α2肾上腺素受体减轻多次七氟烷麻醉引起的远期认知功能障碍。