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研究背景急性肾损伤（Acute kidney disease,AKI）是临床常见的综合征,主要表现为肾功能急速减退和代谢废物的蓄积。AKI的病因包括感染,药物,缺血再灌注等,而由内毒素脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）导致的脓毒症是引起AKI的常见病因。在ICU患者中,脓毒症导致的AKI约占AKI发病率的一半。脓毒性AKI主要病理表现为肾小管上皮细胞空泡变性和凋亡,肾间质炎性细胞浸润,内皮细胞损伤等。巨噬细胞的激活与内皮细胞的损伤参与了脓毒性AKI的进展,但是具体机制仍不清楚。外泌体（Exosomes,EXO）是细胞衍生的直径约为30-100nm的膜结构样小泡,其内可包含脂质,蛋白质,核酸等。外泌体可以转运功能成分到受体细胞,调节受体细胞的功能,是细胞与细胞之间交流的重要媒介。已有研究证实在白蛋白诱导的肾小管上皮细胞产生的外泌体可以使巨噬细胞活化成M1型,参与肾脏间质炎症的发展。另有研究证实巨噬细胞产生的外泌体在结晶体肾病中可以促进巨噬细胞吞噬作用以及单核细胞的迁移等。但是,巨噬细胞来源的外泌体在脓毒性AKI中内皮稳态中的作用目前仍不清楚。在本研究中,我们探究在脓毒性AKI中,巨噬细胞来源的外泌体是否以及如何参与了内皮细胞的损伤。研究目的巨噬细胞来源的外泌体是否参与了脓毒性AKI中内皮细胞的损伤及其调节机制。研究方法1.体外实验1)培养巨噬细胞系RAW264.7,分别用PBS和LPS处理巨噬细胞,24h后提取培养基上清,经超高速离心后获得纯化的外泌体。用电镜,纳米粒径示踪（Nanoparticle tracking analysis,NTA）以及蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）检测外泌体标记物CD63和CD9鉴定外泌体。2)提纯巨噬细胞来源的外泌体用PKH26预染色。分别将PBS与LPS刺激RAW264.7产生的外泌体（PKH26标记）与大鼠肾小球内皮细胞（Rat glomerularendothelial cells,RGECs）共培养。12h后,用鬼笔环肽染细胞骨架,DAPI染细胞核,共聚焦显微镜下观测PKH26标记的外泌体是否可以被RGECs所内化。3)将PBS和LPS处理RAW264.7产生的外泌体与RGECs共孵育24h后,CCK8检测细胞活力,WB检测VCAM-1,炎症小体（NLRP3,Caspase-1,ASC）以及IL-1β的表达水平。4)酸性鞘磷脂酶（Acid sphingomyelinase,ASM）抑制剂阿米替林20μM预处理巨噬细胞,然后用LPS刺激巨噬细胞,24h后提取巨噬细胞外泌体检测CD63和CD9的表达。2.体内实验1)在C57BL/6雄鼠中建立LPS-AKI模型。24只野生型C57BL/6小鼠分为3组（对照组,模型组-12h,模型组-16h）,每组8只,将LPS用PBS配制为2mg/mL,对照组腹腔注射PBS,模型组腹腔注射LPS（20mg/kg）。分别于12h及16h时处死小鼠取材。取血浆检测尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）,肌酐（Creatinine,Cr）,肾脏组织一部分行免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）和病理染色,一部分用来进行WB检测。肾脏组织行IHC检测巨噬细胞标记物F4/80的表达水平。肾脏皮质组织行WB检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（Neutropil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）,内皮细胞损伤标记物VCAM-1和外泌体标记物CD63的表达。2)收集LPS和PBS处理巨噬细胞产生的外泌体,通过尾静脉注射到C57 BL/6小鼠中,24h后处死小鼠。取血浆检测肌酐和尿素氮变化,取肾脏组织进行病理染色。WB检测肾脏损伤指标NGAL和内皮细胞损伤标记物VCAM-1的表达。3)将繁殖好的ASM+/-敲基因C57 BL/6小鼠与同批次野生型C57 BL/6小鼠各分为2组,对照组（PBS）与模型组（LPS 20mg/Kg）,腹腔注射16h后取材。取血浆行肌酐和尿素氮检测,肾脏组织行病理染色。WB检测肾脏损伤指标NGAL以及内皮细胞损伤标记分子VCAM-1的表达水平。研究结果1.体外实验1)LPS刺激下巨噬细胞分泌外泌体增加。2)LPS刺激巨噬细胞产生的外泌体可以导致RGECs的损伤,表现为细胞活力下降,内皮细胞粘附分子VCAM-1升高,以及NLRP3炎性小体的活化。3)抑制ASM后,可以抑制巨噬细胞外泌体分泌。2.体内实验1)LPS-AKI小鼠肾脏中,巨噬细胞浸润增加,外泌体分泌增加。2)LPS刺激巨噬细胞产生的外泌体可导致肾脏损伤加重,NGAL和VCAM-1蛋白表达水平显著升高。3)LPS-AKI模型中,ASM+/-敲基因小鼠肾脏,NGAL和内VC AM-1较野生型小鼠明显降低。说明AKI时,抑制ASM活性可减少内皮细胞损伤和肾脏损伤。结论LPS诱导的AKI中,巨噬细胞浸润增加,分泌外泌体增多。这些携带致病物质的外泌体的内化,加重肾小球内皮细胞的损伤,炎症反应的活化,在脓毒性AKI的发生发展中发挥了重要的作用。