随着人们物质生活水平的提高以及体育活动的减少,导致肥胖及其相关代谢疾病的发病率显著增加,继而损伤机体的健康。所以,近年来寻求一种绿色高效的减肥手段一贯被研究者所重视。然而膳食油脂作为引起体内脂质沉淀的主要原因,对机体的生物学作用和内在分子机制不甚清楚。本论文采用组合生物学技术,对非酒精性脂肪肝病(NAFLD)细胞模型的建立、脂肪酸(FA)对该模型细胞凋亡、氧化压力、免疫调控和脂质代谢的分子作用机制进行了非常全面的探讨。采用MTT细胞活性检测法、LDH细胞坏死检测法、Hoechst 33342染色对细胞凋亡测定法、油红O染色法和甘油三酯(TG)定量测定法、扫描电镜对细胞膜损伤程度检测法对建立符合人类自然病规律的NAFLD模型(最大脂质沉淀和较低的细胞毒性)的条件进行了探索。采用检测细胞凋亡的Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪法(FCM)和Hoechst33342/PI荧光显微镜法、细胞的抗氧化及氧化压力的酶标仪测定法、差异蛋白测定的蛋白组学法、WB以及ELISA结合荧光定量PCR技术考察了免疫因子的表达,研究膳食中FA的种类对人肝脂变细胞凋亡、免疫调控和氧化压力的影响,探究促进NAFLD到进一步肝损伤的机制。采用MTT细胞活性检测法、油红O染色和TG定性定量测定法以及脂代谢基因型荧光定量PCR、ELISA与WB相结合的方法,对中碳链脂肪酸(MCFA)对NAFLD细胞脂滴的聚集及相关脂代谢的分子作用机制进行了全面的探究。本研究的主要结果总结如下:第1章绪论部分对MCFA的生物学特性和NAFLD的研究进展分别做了综述,并对引起NAFLD的分子作用机制作出了展望。FA生物学特性,包括FA的代谢特点、生理功能、安全性和潜在的局限性的研究进展。NAFLD研究部分包括该病发病的原因、模型的建立、引起的细胞凋亡、氧化压力、免疫调控和相关脂代谢信号通路的研究进展。第2章对建立符合人类自然疾病规律的NAFLD模型的最适条件进行了探索。通过MTT和LDH相互验证的实验方法考察混合FA(油酸:棕榈酸=2:1)和单一FA(油酸)对L02和HepG2两种肝细胞的增殖与凋亡的影响,结果发现FA对细胞的毒性均产生浓度和时间依赖性,当浓度低于400μM时,不会对细胞的活性存在影响,且LO2细胞对FA的毒性影响较HepG2肝细胞更加敏感。进一步通过Hoechst染色法对细胞凋亡的检测结果说明细胞凋亡的程度与FA的浓度呈正相关,在浓度小于400 μM时,与对照组相比均不会明显引起细胞的凋亡;浓度升高到800 μM时,均可引起细胞的毒性。通过油红O染色定性观察细胞内的脂滴及细胞的形态,磷酸甘油氧化酶法定量对胞里TG含量的测定,结果表明FA混合物相对于单一 FA更适合用来建立肝脂变细胞模型;当混合FA与LO2细胞孵育时间为24 h,作用终浓度为200μM 时,到达最高的脂质沉淀且造成的肝细胞慢性损伤和NAFLD的慢性肝脂肪变接近。第3章通过研究膳食中FA的种类对人肝脂变细胞凋亡和氧化压力的影响,探究促进NAFLD到进一步肝损伤的机制。通过对细胞凋亡分析表明:同LCFA对比,MCFA能显著降低早、中、晚期凋亡细胞和坏死细胞的百分比,同时抑制Caspase3和Caspase9酶的活性。氧化分析结果表明:采用蛋白双向电泳及二级质谱方法研究发现LCFA能抑制抗氧化酶的产生;进一步通过对SOD、MDA、GSH和ROS的测定也发现MCFA不会产生氧化压力,而LCFA会对细胞产生氧化压力。本章结果表明:通过改变膳食中FA的种类可抑制肝脂变细胞的进一步损伤,不会促进该病的进一步恶化。第4章通过检测膳食中FA的种类对人肝脂变细胞免疫调控的影响,探究促进NAFLD到进一步肝炎的发病机制。通过对NO和iNOS测定分析表明:MCFA组与NR组对比不会引起NO和iNOS水平增加,LCFA亦不会引起NO和iNOS的显著增加。细胞免疫分析表明:MCFA不能促进IL-6、IL-1-β和TNF-α经典免疫因子的分泌,而LCFA具有类似LPS的作用,能显著提高上述免疫因子的产生。本章结果表明:FA引起肝脂变细胞的凋亡不依赖于NO和iNOS途径,且LCFA能强烈引起细胞的免疫应答,摄入含MCFA的油脂对NAFLD的进一步恶化为NASH起着积极的作用。第5章脂质在肝脏中过量沉积会引起肝细胞功能的紊乱,进而促进脂肪肝的形成危害机体的健康,但引起脂滴在肝细胞里聚集的机制仍未能得到明确的解释。本章探究MCFA对NAFLD细胞中脂质代谢的影响,试图寻找日常饮食中脂肪的替代品。油红O染色和TG检测实验暗示:与LCFA(油酸,C18:1)对比,MCFA可显著降低肝脂变LO2细胞内脂滴的积累,具有类似吉非罗齐药物的降脂效果。RT-PCR和WB的研究结果表明:MCFA通过下调LPL、FAS、ACC、LXR-α、CD36和SREBP-1脂肪生成基因的在肝脂变细胞内的表达,同时上调ATGL和HSL加速脂肪氧化分解基因的表达,从而使细胞内TG的聚集得到改善,最终使肝细胞的脂肪变程度得到缓和。第6章结论与展望部分对MCFA对NAFLD细胞模型细胞凋亡、抗氧化体系、免疫调控和脂质代谢的分子作用机制进行了归纳,对后续研究工作进行了展望。综上所述,膳食中油脂与NAFLD细胞模型的相互用的分子机制仍需进一步探究。本文从NAFLD细胞模型的建立,以及MCFA对该模型中细胞的活性与凋亡、抗氧化体系、脂质沉淀和免疫反应的生物学作用,并从细胞和分子水平探讨了 MCFA对该模型脂质代谢和免疫调控相关机制。本论文对肥胖人群合理选择食物中FA的种类具有肯定的指导作用,为NAFLD的预防及治疗提供了科学依据。