论文部分内容阅读
目的：
本课题拟通过多囊卵巢动物模型，探究调控卵泡生长发育的重要基因pten在多囊卵巢组织中的表达，并利用携带pten shRNA慢病毒载体转染在体卵巢，观察pten下调对多囊卵巢形成的影响。为深入了解多囊卵巢的致病机制增添新资料，为临床诊疗女性相关疾病提供有价值的理论依据。
方法：
1.建立多囊卵巢综合征大鼠模型，并利用放射免疫检测血清相关激素、卵巢组织HE染色判断造模是否成功。
2.利用免疫组化、RT-PCR、Western blot等方法观察多囊卵巢组织中ptenmRNA和PTEN的表达及变化。
3.设计、构建携带pten shRNA的慢病毒载体，利用RT-PCR检测携带ptenshRNA慢病毒载体的沉默效率，选择抑制作用最强的pten shRNA慢病毒载体。
4.将携带pten shRNA的慢病毒载体微注射在体卵巢，通过RT-PCR、Westernblot等方法观察pten下调对多囊卵巢形成的影响，放射免疫同步检测血清相关激素的变化。
结果：
1.利用炔诺酮+hCG造模法，模型组大鼠卵巢外形增大，重量极显著高于12天对照组(P<0.01)，卵巢表面出现较多囊性扩张卵泡。组织HE染色发现：与12天对照组相比，原始卵泡数极显著低于对照组(P<0.01)，窦前卵泡数极显著高于对照组(P<0.01)，窦状卵泡数明显减少(P<0.01)，囊性扩张卵泡和闭锁卵泡明显增多(P<0.01)。颗粒细胞层较少，颗粒细胞排列松散甚至脱失。血清激素检测显示LH、T、INS以及LH/FSH明显升高(P<0.01)。
2.免疫组化结果显示：对照组与模型组中，PTEN蛋白在各级卵泡均有表达，在原始卵泡主要表达于卵母细胞胞浆，在窦前卵泡、窦状卵泡以及扩张、闭锁卵泡中主要表达于颗粒细胞。
3.RT-PCR、Western blot结果显示：随着卵巢发育，12天对照组pten mRNA和PTEN蛋白含量均低于0天对照组(P<0.05)，而模型组pten mRNA和PTEN蛋白含量则显著高于0天对照组与12天对照组(P<0.01)。
4.利用pten shRNA的慢病毒载体转染各组在体卵巢，12天后卵巢行冰冻切片荧光显微镜下观察GFP的表达，结果显示：pten shRNA+模型组以及空白载体+模型组有明显荧光。此外，慢病毒pten shRNA+模型组卵巢大小、重量均显著减少，HE染色显示囊性扩张卵泡和闭锁卵泡数减少，血清激素检测显示T下降(P<0.01)。RT-PCR和Western blot结果均显示：pten shRNA+模型组的ptenmRNA和PTEN蛋白水平均显著低于模型组与空白载体+模型组(P<0.01)。
结论：
1.炔诺酮+hCG造模法是制备PCOS大鼠模型的有效方法。
2.pten mRNA和蛋白在多囊卵巢组织中表达显著增强。
3.通过携带pten shRNA慢病毒转染，使在体卵巢pten下调后，对多囊卵巢的形成具有抑制作用。