棉花开放花蕾基因的精细定位及功能初步验证

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棉花是一种重要的经济作物,是纺织品和化工用品的主要原料之一,同时也是重要的战略物资。棉花开放花蕾性状来源于海岛棉和陆地棉种间杂交的F2代,将其应用于杂交育种,可以节省大量人力物力,在棉花杂种优势利用中具有巨大的应用价值。为探究控制棉花开放花蕾性状的遗传基础,本研究以正常柱头TM-1和开放花蕾CSB-18为材料,构建分离群体对该性状(open bud1,ob1)进行精细定位,根据棉花参考基因组注释信息筛选和克隆候选基因并进行初步验证。主要结果如下:1.在花蕾生长发育阶段,CSB-18和TM-1相比,苞叶大小和柱头长短没有明显差异,但在花蕾发育后期,CSB-18花瓣的长度和宽度小于TM-1花瓣,推测开放花蕾性状的出现是由于花瓣较小,花蕾发育不协调,导致柱头和雄蕊被动外露引起的。2.以TM-1为母本、CSB-18为父本构建了F2作图群体和BC1群体,利用这些群体对ob1基因遗传分析。在162个单株的F2小群体中,构建了一张全长为60cM的遗传连锁图,包含10个与目的基因连锁的标记。目标基因被初定位在BNL 2652和BNL 4079之间,遗传距离约6 cM。通过增加定位区间的标记和分析F2大群体,利用交换单株缩小定位区间,最终将目标基因缩小到标记n5760-58与25377之间450kb的区间内。在该区间内发现13个候选基因,根据棉花及拟南芥同源注释信息,发现GhD13G0802为MYB106和AmMixta的同源基因,在拟南芥和金鱼草中调控表皮毛的发育,因此,GhD13G0802可能为棉花开放花蕾性状的候选基因。3.通过实时荧光定量PCR对棉花开放花蕾基因的表达模式进行分析,发现该基因在TM-1的花瓣、柱头中特异高表达,在棉纤维、花萼、苞叶、胚珠、新叶中表达量相对较少,在根、茎、子叶、老叶等部分基本不表达;在海岛棉XH43的花瓣中高水平的表达,在其他组织表达量很低。通过比较分析,在花蕾发育前期(开花前20d),两种材料的花瓣中表达量高,后期(开花前10d)表达量下降,在不同时期的花瓣中基因表达量有差异,在不同时期的柱头中表达量没有显著差异。据此推测,开放花蕾性状的形成是该基因在花瓣中特异表达引起的,进一步确认GhD13G0802为棉花开放花蕾性状的候选基因。4.将TM-1的GhD13G0802表达序列重组到植物表达载体PBI121上,构建了该基因的超表达载体,并采用农杆菌花序侵染法成功获得了24株转基因拟南芥,T2代植株叶片和花瓣表型观察表明,超表达拟南芥与野生型拟南芥的叶片表皮毛、花瓣大小无显著差异。
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