研究背景及目的:结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。2018年最新资料显示,结直肠癌的发病率占全球恶性肿瘤第三位,死亡率占第二位。在我国,结直肠癌的发病率和死亡率也在逐年上升,对我国居民健康造成巨大威胁。结直肠癌的发生、发展、侵袭和转移是一个极其复杂的过程,尽管近年来对结直肠癌发病机制的研究使得我们对其认识更加深刻,但肿瘤微环境在结直肠癌发生发展中的作用仍有待于进一步研究。肿瘤微环境是肿瘤细胞发生发展的局部环境,是一个动态、复杂的综合系统,肿瘤微环境的维持和改变受到包括肿瘤细胞、内皮细胞、基质细胞和免疫细胞在内的多种细胞的信号交流和功能调节。巨噬细胞是肿瘤微环境中重要的细胞组分,在免疫调节和代谢调控中发挥着重要作用,因此又被称为肿瘤相关巨噬细胞。研究表明,肿瘤相关巨噬细胞的功能状态具有高度可塑性,能够根据环境发生相应的改变。目前肿瘤相关巨噬细胞研究中的经典理论是将其主要分为M1型和M2型巨噬细胞,M1型巨噬细胞发挥杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤进展的作用,而M2型巨噬细胞发挥抑制肿瘤杀伤、促进肿瘤进展的作用。研究表明,结直肠癌细胞能够“驯化”肿瘤组织中的巨噬细胞,促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞方向分化,然而其“驯化”机制和关键的作用靶点尚不明确。DDX39是RNA解旋酶DEAD Box家族一员,该家族分子参与天然免疫识别、胞内信号通路调控、核内表观遗传调控和RNA转录与剪切等过程。本课题组前期研究发现,在结肠癌小鼠模型中,肿瘤组织中巨噬细胞内DDX39的表达含量显著低于健康小鼠肠道组织中的巨噬细胞。临床标本检测表明,DDX39在肿瘤组织间质中的表达也明显低于正常肠粘膜、癌旁组织及腺瘤组织间质,且DDX39在肿瘤组织间质中的低表达与结直肠癌患者的不良预后相关。此外,DDX39与巨噬细胞通用的标志分子F4/80发生共定位,而与M2型巨噬细胞的标志分子CD163不发生共定位,且DDX39与CD163的表达水平呈负相关。上述结果提示DDX39可能与肿瘤组织中巨噬细胞的功能状态相关。在肿瘤组织中,肿瘤相关巨噬细胞的功能状态受到肿瘤细胞的调控,既往研究表明,肿瘤细胞来源的外泌体在这一过程中发挥着重要的作用。外泌体是直径介于30～100 nm之间、由细胞主动分泌的膜性囊泡,其内包裹有蛋白质、脂质、糖复合物、微小RNA(miRNA)等多种内容物,而miRNA常常是外泌体发挥调控作用的重要媒介。在胰腺癌和乳腺癌中,肿瘤细胞来源外泌体中的miRNA能够调控巨噬细胞的功能,但结肠癌细胞来源的外泌体对于其微环境中的巨噬细胞功能状态的影响目前还有待进一步研究。本课题基于课题组前期研究成果,一方面通过检测不同功能状态的巨噬细胞中DDX39的表达水平,以及沉默巨噬细胞内DDX39表达后检测巨噬细胞功能状态的改变,探究DDX39对巨噬细胞功能状态的影响;另一方面通过收集肠癌细胞来源的外泌体,并体外处理巨噬细胞,检测巨噬细胞功能状态的改变,探究结直肠癌细胞来源的外泌体对巨噬细胞的功能影响;此外,本研究结合生物信息学分析,探究DDX39在巨噬细胞中可能参与的信号通路,并探究结直肠癌细胞来源外泌体中可能参与调控巨噬细胞分化的关键miRNA分子。方法:本研究主要包括两部分。第一部分主要探究DDX39对巨噬细胞分化的影响。首先,我们将人单核白血病细胞系THP-1诱导分化为M1和M2型巨噬细胞,利用RT-PCR技术、Western Blot技术及流式细胞术检测两种功能状态的巨噬细胞中DDX39的表达水平。其次,我们利用特异性针对DDX39的sh RNA敲低巨噬细胞中DDX39的表达,利用RT-PCR、ELISA及流式细胞术检测M1和M2型巨噬细胞的标志分子,从而探究DDX39的敲低对巨噬细胞的分化方向的影响。此外,我们收集沉默DDX39表达的巨噬细胞的培养上清,用其处理肠癌细胞系HT-29,利用CCK-8检测HT-29增殖能力的改变。在该部分中,我们还分析了GEO数据库中M1和M2型巨噬细胞差异表达基因,并进行GO和KEGG通路富集分析,探究DDX39可能参加的信号通路。第二部分主要探究结直肠癌来源外泌体对巨噬细胞分化及DDX39表达的影响。首先,我们构建肠癌细胞及巨噬细胞共培养体系,利用RT-PCR技术检测M1和M2型巨噬细胞的标志分子,从而探究巨噬细胞的分化方向。其次,我们采用超速离心法收集HT-29培养上清中的外泌体,并采用透射电镜技术、样品粒径分布检测及Western Blot技术对外泌体进行鉴定。之后,我们开展外泌体与巨噬细胞的共孵育实验,采用荧光染色的方法检测巨噬细胞对外泌体的吞噬情况,在确定外泌体被巨噬细胞摄取后,我们利用RT-PCR、ELISA及流式细胞术检测巨噬细胞的标志分子,从而探究巨噬细胞的分化方向。此外,我们还利用RT-PCR及Western Blot技术检测外泌体处理后巨噬细胞中DDX39的表达水平。在该部分中,我们还分析了GEO数据库中结直肠癌病人和健康志愿者外周血外泌体中miRNA差异表达情况,并利用Target Scan数据库预测可能参与DDX39表达调控的miRNA,以期发现肠癌细胞来源外泌体中可能参与调控巨噬细胞分化的关键miRNA分子。结果:在第一部分中,RT-PCR结果提示M1型巨噬细胞中DDX39在m RNA水平上的表达含量高于M2型巨噬细胞,Western Blot和流式细胞术结果提示M1型巨噬细胞中DDX39在蛋白质水平上的表达含量高于M2型巨噬细胞。RT-PCR及Western Blot结果提示通过基因沉默技术,我们成功地敲低巨噬细胞中DDX39的表达;RT-PCR结果提示当DDX39的表达水平降低时,M1型巨噬细胞的标志物TNF-α和IL-1β的表达水平下降,而M2型巨噬细胞的标志物CD206的表达水平上调。ELISA结果提示当DDX39的表达水平降低时,M1型巨噬细胞的标志物IL-12的分泌水平下降,而M2型巨噬细胞的标志物IL-10的分泌水平上升。流式细胞术结果提示当DDX39的表达水平降低时,CD206+的巨噬细胞比例增加。CCK-8实验结果提示,使用沉默DDX39表达的巨噬细胞来源的培养上清处理后,HT-29的增殖能力增强。以上结果表明DDX39在巨噬细胞的分化方向中起到重要作用。此外,GEO数据分析结果发现M1型和M2型巨噬细胞共有1586个差异表达基因,基因富集分析表明,M1型巨噬细胞表达上调的基因主要参与天然免疫,M2型巨噬细胞表达上调的基因主要参与免疫调控。在第二部分中,RT-PCR结果表明,与HT-29细胞共培养后巨噬细胞内DDX39在m RNA水平表达下降,M1型巨噬细胞的标志物TNF-α和IL-1β在m RNA水平上表达下降,而M2型巨噬细胞的标志物CD206在m RNA的表达水平上升。透射电镜观察收集到的外泌体形态呈圆盘状,粒径分析表明其粒径大小主要集中在40-100nm,Western Blot结果表明收集到的外泌体标志蛋白CD63表达上调。外泌体与巨噬细胞共孵育实验中,荧光染料标记的外泌体与巨噬细胞共培养24小时后,荧光显微镜观察发现红色荧光标记的外泌体与绿色和蓝色荧光标记的巨噬细胞重合,提示外泌体能够被巨噬细胞吞噬。RT-PCR结果提示巨噬细胞吞噬HT-29来源的外泌体后,M1型巨噬细胞的标志物TNF-α和IL-1β的表达水平下降,而M2型巨噬细胞的标志物CD206的表达水平上升,且DDX39的表达下调。ELISA结果提示M1型巨噬细胞的标志物IL-12的分泌水平下降,而M2型巨噬细胞的标志物IL-10的分泌水平上升。流式细胞术结果提示CD206+的巨噬细胞比例增加。RT-PCR结果及Western Blot结果提示巨噬细胞吞噬HT-29来源的外泌体后,DDX39的表达水平下调。以上结果提示着外泌体中存在的成分对DDX39的表达起到调控作用,从而影响巨噬细胞的分化方向。有趣的是,我们通过GEO数据分析结果发现,不同分期的结直肠癌病人相比健康志愿者外周血外泌体中共有45个表达上调的miRNA,其中hsa-miR-654-5p和hsa-miR-133a具有调控DDX39的潜能。结论:1、DDX39能够影响巨噬细胞的分化方向。当DDX39的表达水平降低时,巨噬细胞向促进肿瘤进展的M2型巨噬细胞方向分化。2、肠癌来源外泌体能够促进巨噬细胞向促进肿瘤进展的M2型巨噬细胞方向分化,并降低DDX39的表达水平。Hsa-miR-654-5p和hsa-miR-133a可能是外泌体参与巨噬细胞分化方向调控的关键分子。