FKBP51对破骨细胞分化的调节作用及机制

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研究目的:骨质疏松症(osteoporosis)是常见的骨代谢性疾病,以骨密度降低、微结构破坏和骨脆性增加为主要临床病理特征。随着我国人口老龄化进程,骨质疏松症的患病率持续上升,严重危害人类健康。破骨细胞数量和(或)功能的异常是骨质疏松症的重要病理机制。RANKL/RANK/OPG是破骨细胞分化最重要的调节因子/受体,其通过 NF-κB(nuclear factor-kappa B),MAPKs(mitogen-activated protein kinases)等信号通路参与破骨细胞增殖、分化和成熟等调控。FKBP51属于亲免素蛋白家族中的一员,具有复杂广泛的细胞生物学作用,它在应激、肿瘤、激素依赖性疾病、生殖、脂质代谢和免疫等方面均发挥重要的调节作用,FKBP51还参与调控NF-κB与AKT等信号通路。我们的前期研究发现FKBP51V55L突变可以增强破骨细胞分化及功能而参与Paget骨病的发生、发展。研究发现RA(rheumatoid arthritis)患者破骨细胞前体细胞内FKBP51 mRNA表达水平明显增高,另外通过上调FKBP51的表达发现FKBP51促进了破骨细胞的分化与成熟,但分子机制尚不清楚。本研究旨在探究FKBP51对破骨细胞分化的作用及机制,为骨质疏松症的防治提供新的方向。研究方法:1.FKBP51对破骨细胞分化的影响:RAW264.7细胞感染FKBP51慢病毒或转染敲减质粒,建立FKBP51细胞过表达或敲减细胞模型;细胞用50ng/ml RANKL因子诱导2-3天,进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,计数TRAP染色阳性且细胞核≥3个的多核细胞,分析FKBP51对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响。2.RT-PCR:通过RT-PCR检测破骨细胞分化标志性分子CTR,CTSK,OSCAR和破骨细胞分化相关转录因子c-Fos,NFATc1,PU.1,MITF,TRAF6,Blimp1的mRNA表达水平,进一步在分子水平上验证FKBP51对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的作用。3.Western blot:利用Western blot分析破骨细胞分化关键性转录因子c-Fos和NFATcl的蛋白表达水平;检测破骨细胞分化相关的AKT,NF-κB和MAPKs(包括P38,JNK,ERK)信号通路相关蛋白的磷酸化水平,探索FKBP51调节破骨细胞分化的作用机制。结果:1.FKBP51过表达与敲减模型的建立:慢病毒感染组FKBP51的蛋白表达水平明显高于对照组(P><0.05);质粒敲减组FKBP51的蛋白表达水平明显低于对照组(P<0.05),即成功构建FKBP51过表达与敲减细胞模型。2.FKBP51促进RAW264.7细胞向破骨细胞的分化:在RANKL因子的诱导下,FKBP51过表达组破骨细胞的数目明显多于对照组(P<0.05),FKBP51敲减组破骨细胞的数目明显低于对照组(P<0.05),表明FKBP51促进RAW264.7细胞向破骨细胞的分化。3.FKBP51过表达促进破骨细胞分化标志性分子的表达:与对照组相比,FKBP51过表达细胞破骨细胞标志性分子CTSK,CTR和OSCAR的mRNA表达水平升高(P<0.05),在分子水平上证明FKBP51过表达促进RAW264.7细胞向破骨细胞的分化。4.FKBP51过表达上调破骨细胞分化相关转录因子的表达:FKBP51过表达细胞及对照经RANKL诱导后,其分化过程中的关键性转录因子c-Fos和NFATcl早期的蛋白与mRNA表达水平均升高(P<0.05),其他相关转录因子TRAF6,MITF,PU.1和BLIMP1的mRNA表达水平也升高(P<0.05)。5.FKBP51参与调控AKT、NF-κB、MAPKs信号通路:Western blot结果显示,FKBP51过表达下调AKT Ser473位点的磷酸化水平,而Thr308位点的磷酸化水平无明显差异;FKBP51过表达激活了 NF-κB,MAPKs(P38,特别是JNK,ERK)信号通路(P<0.05)。结论:FKBP51可能通过激活NF-κB,MAPKs信号通路上调破骨细胞分化关键性转录因子c-Fos和NFATc1的表达,进而上调破骨细胞标志性分子CTR,CTSK和OSCAR等的表达,促进破骨细胞分化。
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