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目的:Duchenne肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是X连锁的隐性遗传病,其是由编码肌营养不良蛋白的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因突变引起的,其临床表现为进行性的四肢无力和肌萎缩,病理表现为肌细胞的萎缩和坏死,但其发病机制尚不清楚,且无有效的治疗方法。研究发现,自噬及其调控通路在肌细胞的萎缩和坏死过程中发挥重要作用,成为研究的热点。此外,我们前期通过电镜不但发现DMD患者肌肉组织自噬泡增多,同时发现线粒体形态学和数目的异常。基于此,本研究主要是应用DMD的模型mdx小鼠观察mTOR(Mammalian Target of Rapamycin,mTOR)相关自噬调控通路在线粒体形态学异常以及肌肉萎缩和坏死过程中所处的地位和作用,明确其病生理机制,病寻找可能的药物干预靶点。方法:选取8周龄mdx雄性小鼠和同龄对照组C57小鼠(各组3只)的股四头肌肌肉组织,进行HE、MGT和ACP染色观察肌肉组织病理学改变,应用电镜技术观察线粒体的形态变化,应用免疫荧光染色技术观察自噬泡标志物LC3和线粒体标志物VDAC的共定位情况,利用Western Blot技术分析mTOR相关自噬调控通路蛋白水平(LC3、P62、FOXO1、P-4EBP1和4EBP1),应用Real-Time PCR技术分析LC3、P62、Pink1,parkin和Tfeb基因的表达水平。结果:1.8周龄的mdx小鼠股四头肌肌肉组织活检常规染色显示肌纤维束边界清楚,肌束衣和肌内衣结缔组织明显增生,血管结构未见异常,少量炎细胞浸润。肌束内肌纤维排列疏松,大小不等,基本呈圆形外观,可见高收缩纤维,坏死和吞噬肌细胞,可见核内移、肌再生、肌分裂和空泡样纤维,可见炎性细胞浸润。ACP染色可见部分区域酶活性增高。2.透射电子显微镜发现线粒体形态学和线粒体数量的改变,如线粒体体积变小,数量增多,并出现线粒体肿胀、嵴消失,严重者可出现空泡样改变。3.免疫组织荧光染色可见mdx小鼠肌肉组织中线粒体线粒体标记物VDAC和自噬泡标记物LC3的团块状聚集,同时两者的共定位增加。4.Western Blot可见LC3和P62蛋白表达上调,FOXO1蛋白和EIF4EBP1和P-e IF4EBP1蛋白表达下调,结果均具有统计学意义(P<0.05)。5.RT-PCR显示P62、LC3、Pink1、parkin和Tfeb与对照组相比明显的上调,结果均具有统计学意义(P<0.05)。结论:8周的mdx小鼠骨骼肌组织的存在变性和坏死。骨骼肌组织内线粒体形态学出现异常,提示自噬障碍或自噬“不足”。P62和LC3蛋白水平上调提示自噬泡和自噬相关蛋白表达增加,结合自噬相关蛋白Pink1、parkin、TFEB、P62基因水平表达上调,强烈提示在8周的mdx小鼠骨骼肌组织中自噬通量增加,自噬是激活的。同时,mTOR信号通路下游EIF4EBP1、P-e IF4EBP1和FOXO1蛋白水平表达下调,提示了mTOR信号通路的抑制,进一步证实自噬通路的激活。综合分析,8周的mdx小鼠骨骼肌组织的即存在变性和坏死,基本可模拟DMD患者的肌肉病理改变,同时还发现该阶段自噬通路是激活的,线粒体形态学异常考虑可能和自噬激活“不足”相关,其具体机制仍需进一步详细研究。