大肠癌是一常见的恶性肿瘤,在西方发达国家发病率居恶性肿瘤谱的第二位。上世纪90年代与70年代相比,我国大肠癌的发病率在城市上升了31.95%,在农村上升了8.51%;大肠癌的发病年龄高峰在40-50岁,死亡率位居恶性肿瘤死亡谱的第4或第5位。据预测,我国大肠癌的发病率和死亡率在今后很长的一段时期内将稳步上升。然而,大肠癌的治疗效果并不理想,在所有的病人中约有半数患者治疗失败。大肠癌传统的主要治疗方法有三种,即手术治疗、放射治疗、化学治疗。由于上述治疗方法的不断发展和完善,在延长大肠癌病人生存期和提高病人生存质量方面已取得了很大进步。但是手术和放疗是局部治疗,难以控制肿瘤的复发和转移;化疗药物不具备组织选择性,对骨髓等正常组织产生严重的毒副作用。近年来,生物治疗作为治疗恶性肿瘤的第四种方法得到蓬勃发展,在大肠癌治疗的基础研究中发展迅速。肿瘤疫苗是肿瘤生物治疗的重要组成部分,近年来的研究发展十分迅速,为大肠癌的治疗开辟了新的途径。 肿瘤疫苗的基本原理是利用肿瘤抗原激发机体自身的免疫保护机制,达到治疗和预防复发的作用。肿瘤细胞为载体的肿瘤疫苗是将自身或异体同种肿瘤细胞通过物理、化学和生物等方法(如加热、放射线照射、神经氨酸酶酶解等)处理,使之成为失去致瘤性,但保持抗原性的肿瘤瘤苗。以肿瘤细胞为载体的肿瘤疫苗的最大特点是来源于自身或同种异体的肿瘤细胞带有肿瘤特异性或相关性抗原,无需如其它疫苗所需的抗原鉴定、筛选或纯化过程。但是由于肿瘤细胞表面抗原的免疫原性较弱,原始的肿瘤细胞制备的肿瘤疫苗往往不能诱导很强的免疫应答。为改变这一不足,随着基因工程技术的发展,可采用分子修饰技术改变肿瘤细胞的免疫特性或遗传背景,以提高其免疫原性,诱导更强的免疫应答。细胞因子在免疫浙江大学博卜研究生毕业论文应答的诱导和效应阶段具有重要的作用。在免疫应答的起始阶段,细胞因子是必不可少的,细胞因子有调控免疫应答、活化效应细胞的复杂功能,尤其是CTL等效应细胞的诱生更是离不开诸如IL一2等细胞因子,因此将细胞因子编码基因导入肿瘤细胞制备的肿瘤瘤苗可增强瘤苗的特异性免疫应答l9]。 应用分子生物学技术,采用转基因手段以某些细胞因子基因修饰肿瘤细胞,提高其免疫原性或活化效应细胞的能力是肿瘤疫苗新的研究热点〔’“I。Yeil川等将GM一csF基因修饰黑色素瘤细胞,其表达定位T-黑色素瘤细胞的细胞膜上,结果发现能促进瘤苗细胞与GM一CSF受体阳性APC细胞的相互作用而增强肿瘤抗原的递呈,在小鼠模型体内诱导了比分泌性GM一CSF更强的免疫应答,并对野生型肿瘤细胞的攻击更具保护力。 白细胞介素一18(Interleukin一18,IL一18)是近年发现的一种多功能免疫调节蛋白。它在体内分布厂’泛,而且作用呈多样化,除了诱导多种细胞因子产生、上调Fas配体的表达,介导T细胞及NK细胞的细胞毒活性、增强机体白然防御和抗肿瘤机能等作用外:研究表明IL一】8也是一种炎性因子,还与骨代谢、神经和造血功能有关l’2,’3】。比一18能明显诱导IFN一丫、lL一2、TNF一a的产生,增强由FaS配体介导的NK细胞、T细胞和骨髓单核细胞的细胞毒活性等方面作用,因而IL一18具有显著的抗肿瘤能力。研究发现1141,给移植MethA肉瘤的小鼠预先注射IL一18后有90%以上的实验动物能长期存活。Miczlleflsl等研究发现腹腔内注射或静脉内注射IL一18可以引发机体对腹腔内注射的白体MethA肉瘤产生抗肿瘤效应,但皮下注射则无效。C26肿瘤细胞接种裸鼠后在13一26天连续注射IL一18能有效抑制肿瘤细胞的生长,可完全抑制其肺部转移,裸鼠的生存期明显延长。IL一18的处理也能明显抑制MCA205肉瘤的生长,并且即使是接种后7大再处理也有效。同样在小鼠黑色素瘤细胞株CLS几接种后连续7大腹腔注射IL一18 lug/只,可明显抑制肿瘤的生长,使肿瘤生成瘤率由60%降至20%。另外,IL一18对小鼠神经角质瘤也有明显的杀伤效应【”l。 基于IL一18的明显抗肿瘤作用,本研究构建含IL一18基因的分泌刑真核表达质粒:将该真核表达质粒转染人肠癌细胞系(s W480细胞),观察!L一18基因转导后人肠癌细胞生物学行为的变化;将IL一18基因转染后的SW480细胞灭活,制备人肠癌基因l:程肿瘤疫苗,观察其抗瘤作用。本课题内容分为四部分:(l)含hIL一18基因的分泌型真核表达质粒的构建;(2)高表达hIL一18的大肠癌单克隆细胞株的建立;(3) hIL一1S基因修饰人肠癌细胞生物学行为的改变;(4)h工L一18基因修饰大肠癌细胞肿瘤疫苗的制备及抗瘤作用研究。浙江人学博士研究生毕业论文第一部分含IL一18基因的分泌型真核表达质粒的构建目的:比一18是一种多效性的细胞因子,可诱导IFN一Y、TNF一。和GM一CSF等细胞因子的产生,能直接调节T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和DC细胞的活性,在抗肿瘤、抗真菌、抗过敏和免疫调节等多方面具有重要作用,本实验构建含IL一18基因的分泌刑真核表达质粒,为后续的实验研究奠定基础。方法:提取人正常肝组织中的mRNA;通过逆转录一聚合酶链反应( RT一PCR),获得IL一18基因的cDNA片段;将其连接于pGEM一T克隆载体,转化感受态细菌,挑取阳性克隆扩增,提取质粒,酶?