高甘油三酯血症大鼠主动脉高血凝相关新基因的筛选、鉴定和克隆

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该研究在我室建立的高血凝大鼠动物模型的基础上,采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,筛选、鉴定和克隆大鼠主动脉高血凝相关新基因.首先我们用高淀粉膳食(糖占总热量80﹪)造成内源性高甘油三酯血症(HTG)的大鼠模型,并对其凝血活性和纤溶活性进行检测,发现HTG大鼠的凝血活性增加而纤溶活性降低,即血液处于高凝状态.这表明用高淀粉膳食成功建立了高血凝大鼠动物模型.抑制性消减杂交(SSH)需要0.5~2ug的mRNA,由于大鼠主动脉组织中总RNA含量低,不足以获得足够量的mRNA以合成dscDNA,因此,我们利用SMART技术从总RNA合成dscDNA.然后,利用SSH dscDNA进行抑制性消减杂交,并将消减产物与pMD18-T载体连接并转化大肠杆菌JM109,成功构建了大鼠主动脉高血凝消减文库.经鉴定该文库的消减效率高,为进一步筛选和克隆高血凝相关新基因奠定了良好的基础.所构建的消减文库扩增后包含约1000个白色克隆.根据HC002 EST(567bp)序列,设计基因特异性引物(GSP1和GSP2)和巢式引物(NGSP1和NGSP2),通过SMART RACE技术分别扩增其5端和3端,成功地得到了约为500bp的5-RACE PCR产物和约为800bp的3-RACE PCR产物.将5-RACE和3-RACE产物克隆并测序,测序结果与EST序列用软件Contig 1拼接成一条1275bp的完整序列,即HCR2基因的全长cDNA,在GenBank中的登录号为AY234417.该研究所构建的大鼠主动脉高血凝相关基因的消减文库,为进一步筛选高血凝相关新基因奠定了坚实的基础.HC002,HC057和HC067可能与高血凝的产生机制有关,也可能与高甘油三酯血症有关.HCR2基因全长cDNA的获得,为进一步研究该基因在心脑血管疾病发生、发展中的作用奠定了基础.
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