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第一部分:规范化小鼠心脏死亡供体肝移植模型的构建[目的]肝脏移植是治疗终末期肝病的唯一有效治疗手段。而供肝短缺成为严重制约肝脏移植发展的难题。心脏死亡供体(DCD)器官捐献成为增加供肝来源的重要策略。由于难以避免的冷热缺血损伤,心脏死亡供体捐献的肝脏面临着短期移植物失功和远期胆道并发症等系列问题。如何减轻损伤,提高心脏死亡供肝的质量成为近年来研究的热点和难点。小鼠在移植免疫、缺血再灌注损伤等方面具有不可比拟的优势,但目前尚无较好的小鼠模型研究心脏死亡供体相关肝移植的损伤,因此需要构建一套统一规范的小鼠无心跳供体肝移植模型,为科研工作者进行相关研究提供动物平台。[方法]本实验构建了一套规范化的小鼠心脏死亡供体肝移植模型,该模型采用动脉重建的方式,以热缺血时间的长短为依据对心脏死亡供体肝移植后的存活时间和肝脏变化进行了研究,以确定最佳动物模型时间。[结果]供体心脏停跳Omin、5min、1Omin和20min后进行肝脏移植,移植术后7天的受体存活率分别为100%,75%,37.5%和12.5%。随着心脏停跳时间的延长,移植术后6h的血清ALT和AST水平显著升高,肝脏组织病理切片显示移植肝细胞从水肿到点状坏死再到片状坏死的变化过程;术后移植肝内IL1α、IL1β、TNFα、IFNγ、IL6、IL10及Kupffer细胞标志物F4/80呈现普遍下降趋势。[结论]随着供体无心跳时间的延长,供肝的缺血/再灌注损伤加重,质量显著下降,移植术后供肝内免疫细胞呈现低免疫应答状态,Kupffer细胞受损丧失,受体存活率显著下降。经过比较,供体心脏停跳1Omin为理想的建模条件,可以保证移植术后受体一定的存活率,同时便于观察干预措施是否有效。第二部分:间充质干细胞对小鼠心脏死亡供体移植肝的保护作用研究[目的]间充质干细胞(MSC)具有多向分化潜能,被证实拥有强大的免疫调节功能,能够安全有效的应用于各种炎症、缺血再灌注损伤、自身免疫性疾病模型中。近年来,MSC被逐渐应用到重症肝炎、肝衰竭乃至肝癌等肝脏疾病领域,成为研究热点。在肝脏移植领域,MSC因其能够抑制免疫排斥反应,减少免疫抑制剂用量得到了越来越多的重视和青睐,而MSC能否对心死亡供体捐献的移植肝起到有效的保护作用还不甚清楚。本实验利用构建的小鼠心脏死亡供体的肝移植模型,验证MSC能否起到保护移植术后心脏死亡供肝的作用。[方法]利用第一部分中构建的规范的小鼠心脏死亡供体肝移植模型,控制心脏停跳时间为1Omin,采用MSC过继输注的方法进行细胞治疗,以观察术后受体存活时间和术后6h肝脏功能及病理指标,评价MSC对心脏死亡供肝的保护作用。[结果]MSC的过继输注可以使心脏停跳1Omin供肝移植后的7天存活率从37.5%显著提升至100%,同时有效减轻术后6h外周血中肝脏ALT、AST的表达和肝脏组织损伤,病理结果显示MSC使移植肝的肝细胞出现极轻微的水肿,有别于对照组肝脏细胞大范围水肿、点状坏死。同时长期观察发现,MSC治疗组术后3月的存活率高达75%,肝功及病理切片显示供肝正常。[结论]MSC的过继输注可以有效保护心脏死亡供体移植肝的质量,减轻肝脏损伤,从而有效提高受体术后存活率。长期观察亦证实MSC的过继输注安全有效,并且不会存在诱发肿瘤的危险。第三部分:间充质干细胞保护小鼠心脏死亡供体移植肝的作用机制研究[目的]心脏死亡供体捐献的肝脏不可避免的存在热缺血/冷缺血/再灌注的损伤,其中又以热缺血对供肝的损伤最为明显。在有效循环灌注丧失的情况下,肝脏进入乏氧状态,肝内的非实质细胞对乏氧非常敏感,其中Kupffer细胞对病理因素的应答对于肝脏的免疫状态起到至关重要的作用。前述部分,我们分别证实了心脏停跳时间的延长显著降低肝脏内Kupffer细胞的数量,同时MSC对无心跳供肝具有保护作用,但MSC和Kupffer细胞之间是否存在联系尚未得知,且MSC具体通过哪种机制发挥保护作用尚无定论。本实验利用上述动物模型,通过体内外实验阐述MSC对供肝保护作用的机制。[方法]利用氯化钆(GdCl3)清除供肝体内的Kupffer·细胞后进行无心跳肝移植,同时进行MSC过继输注,观察术后受体存活情况,明确MSC和Kupffer细胞是否存在联系。利用qRT-PCR法、Immunoassay法、免疫组化及体外细胞共培养等方法探究MSC发挥保护作用的具体机制。[结果]过继输注MSC显著提升了移植肝内Kupffer细胞表面F4/80的表达,同时GdCl3清除供肝Kupffer细胞后,MSC失去了对供肝的保护作用,受体术后生存率显著下降。在保护Kupffer细胞的同时,MSC的过继输注使促炎介质、趋炎因子等的表达均显著下降。体外细胞共培养证实,MSC可以减少过氧化物引起的Kupffer细胞凋亡,PGE2抑制剂则逆转这一保护作用,蛋白印记证实MSC可以抑制Kupffer细胞表达TLR4,进而激活ERK1/2,减少Fas/FasL的表达,减少caspase3的激活,从而抑制Kupffer细胞凋亡。[结论]MSC主要通过PGE2减少缺血再灌注损伤中Kupffer细胞的凋亡,这一保护作用依赖于TLR4-ERK1/2-Fas/FasL-caspase3细胞信号通路;进而抑制肝内炎症因子表达和炎症趋化因子的表达,抑制缺血再灌注损伤造成的非实质细胞凋亡,减轻肝脏损伤,提高供肝质量,从而显著延长受体存活时间。