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生物材料在临床上的安全应用是“人命关天”的大问题,而研究生物材料生物标志物可以在生物材料未植入人体之前,识别生物材料的潜在风险,建立早期、高效、快速、灵敏、准确的安全性评价指标,满足材料初步设计过程中对大量新材料实现高效快速筛选的需求,并能大大减少生物材料研发时间和资金的投入,这是生物材料安全性评价发展的必然要求。镍钛合金由于具有形状记忆效应,在医学领域里,常用于人造骨骼、牙齿矫形丝等。镍钛合金中镍含量较高,在植入人体后,镍离子的释出会导致一定的细胞毒性,因此研究能够早期评估镍离子细胞毒性的生物标志物是很有必要的。目前对镍离子细胞毒性生物标志物的研究都是采用单一组学进行的,缺少基于多组学方法的联合分析,这就会出现基因/蛋白质/代谢物水平上筛选到的生物标志物不一致的问题。而且这些采用组学方法对镍离子生物标志物的研究只是从理论上分析了基因/蛋白质/代谢物标志物的功能,而缺少一系列验证实验来对这些筛选出的标志物进行最终确定,因此目前的生物标志物的筛选研究还只是停留在“纸上谈兵”的阶段,无法用来指导生物材料的研发。为了解决上述两个问题,本论文的目的是采用多组学方法对镍离子细胞毒性生物标志物进行联合筛选,并进行一系列细胞分子生物学实验对筛选出来的生物标志物进行实验验证,最终确定出可用于评估镍离子细胞毒性的生物标志物。同时,对基因标志物、蛋白质标志物和代谢物标志物进行关联性验证,进一步弄清不同层次筛选到的基因标志物、蛋白质标志物和代谢物标志物之间的关联性,确定从基因转录→蛋白质表达→代谢物变化的分子生物学途径。本论文的主要内容如下:1.镍离子细胞毒性实验:采用MTT法评估100μM、200μM的镍离子溶液作用L929细胞不同时间(12h、24h、48h、72h)的细胞毒性,实验表明镍离子会对L929细胞增殖产生影响,具有一定的细胞毒性。2.基因组学实验:以100μM、200μM的镍离子溶液作用不同时间(12h、24h、48h、72h)的L929细胞为实验组,以正常培养基培养的L929细胞为对照组,收集各组的细胞,并寄送至公司进行转录组测序实验。3.生物标志物的筛选:对基因组实验结果和课题组前期得到的蛋白质组学实验/代谢组学实验结果进行分析,筛选出在多个实验组出现差异表达的基因340个,差异表达蛋白质93个,差异表达代谢物9个;通过基因组学和蛋白质组学的联合筛选,找到8个在基因水平和蛋白质水平均发生差异表达的候选基因/蛋白质生物标志物;分别采用KEGG和Metabo Analyt对8个候选基因/蛋白质生物标志物和9个差异表达代谢物进行通路分析,筛选出参与细胞毒性相关通路的基因/蛋白质/代谢物,共得到可以作为目标生物标志物的基因/蛋白质4个,代谢物5个。4.生物标志物表达水平的验证实验:采用RT-PCR和Western blot方法,分别在RNA水平和蛋白质水平上对筛选到的4个基因/蛋白质目标生物标志物进行表达水平实验验证,得到在两个层面上均有较好一致性,且基因/蛋白质表达模式较一致的标志物,并结合相关文献,确定出UQCRB、CSF1这2个目标生物标志物的生物学功能与镍离子细胞毒性相关,可以进行功能水平的验证;采用LC-MS/GC-MS的方法对5个目标代谢物生物标志物进行表达水平实验验证,确定出Sphinganine、Uridine和Hypoxanthine作为潜在的代谢物标志物,用于评估镍离子的细胞毒性。5.生物标志物功能水平的验证实验:首先,通过RNA干扰和过表达技术构建Uqcrb、Csf1基因干扰/过表达稳定细胞株;通过氧化应激实验和线粒体膜电位检测实验,确定出Uqcrb基因具有调控细胞中ROS含量和电子传递的生物学功能,与镍离子细胞毒性涉及的生物过程相关,最终确定UQCRB基因/蛋白质可以作为评估镍离子细胞毒性的最终生物标志物;同时通过细胞增殖实验证明CSF1基因/蛋白质与细胞的增殖没有必然的相关性,确定不选择CSF1基因/蛋白质作为评估镍离子细胞毒性的生物标志物。6.镍离子细胞毒性基因-蛋白质-代谢物标志物关联性验证:分析基因组学、蛋白质组学和代谢组学实验结果,找到在单个实验组发生差异表达,且同时参与相同细胞毒性相关通路的基因/蛋白质/代谢物标志物;对筛选得到的Acot2、Aldh2基因,构建干扰/过表达稳定细胞株;采用Western blot和LC-MS/GC-MS分析基因标志物、蛋白质标志物、代谢物标志物之间关联性。结果表明,镍离子可以自上而下的影响Acot2、Aldh2基因标志物的表达→ACOT2、ALDH2蛋白质标志物的表达→代谢物标志物的变化→可能影响细胞膜的功能、细胞内ROS水平和能量的产生。