前言 骨折愈合是一个使骨折碎片达到骨性连接的过程。骨折后骨折断端由富含具有分化潜能的间质细胞和细胞因子的血肿所充填，骨折断端完成骨痂连接一般经过软骨、骨化和重建三个阶段。NO作为一种自由基气体，其在许多生物学活动中作为第二信使而存在。NO在体内由基本氨基酸L-精氨酸合成，L-精氨酸反应生成L-瓜氨酸和NO的过程由三种NO合酶催化(NOS)，其中两个是少量基本存在的(eNOS和bNOS)，一个为大量诱生型的(iNOS)。 NO参与人体内许多器官的病理生理过程，其在骨科领域，包括炎症、关节炎、骨质疏松、无菌性松动，甚至在骨折愈合中作用的研究正逐步深入。本实验拟在骨折愈合过程中给予NOS的抑制剂L-NAME以及NO的合成底物L-arginine，意图减少或增加骨折后体内NO的合成和释放，通过研究不同时期骨折断端NOS的表达和骨折愈合情况，进一步探讨NO在骨折愈合中的可能作用。 实验材料 1．实验模型的建立： Wistar大鼠60只，随机分为三组，每组20只，分别为L-arg组，L-NAME组及对照组。实验组饮用水含L-arg(20g+500ml水)和L-NAME(1g+500ml水)，对照组只饮用自来水。实验动物首先喂养以上饮用水一天，然后在0.1g/Kg氯氨酮腹腔注射麻醉后，建立股骨闭合骨折模型。 2．标本的取材 骨折模型建立后，在骨折后第3天、一周、H周以及四周分别处死每组各5只大鼠，截取股骨中段骨痴组织及对侧未骨折之股骨约Icm，置10％甲醛液中固定，至骨折后4周所有的骨折标本取材后经用 8 mol／L甲酸叫／L甲酸钠等量混合液中脱钙l－2周，标本正中剖开，纵行切取包含骨折断端的骨痴，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。蜡块纵行切片，厚4pm，分别行HE染色及免疫组织化学法观察。 实验方法 1．HE染色及结果评价标准： 根据HE染色光镜下所见骨痴组织中纤维组织、软骨组织、编织骨组织和成熟骨组织所含比例将骨折愈合程度分为10级，通过观察实验组和对照组的骨颁中以上组织的级别均数来评价骨折的愈合程度。 2．免疫组织化学法瞩P法） 切片常规至脱蜡水化；3％过氧化氢浸泡来阻断内源性过氧化物酶的活性；复合消化液消化 20ndn，血清封闭 30ndn；滴加一抗iNOS人NOS及eNOS过夜；加生物素标记第二抗体30ndn，链亲和素过氧化物酶30ndn，DAB显色3刁0ndn（显微镜下观察）自来水终止反应；苏木素复染 3而n；1％盐酸酒精分化 3秒；流水返蓝15ndn；脱水透明封片同前；各期间 PBS液漂洗，光镜下观察 NOS的表达情况。 3．实验结果分析： 根据y染色后各组标本光镜下所见愈合程度的均数作成配对数据作表，采用t检验。h值为与对照组比较后的结果） ·2· 实验结果 无论实验组还是对照组，未骨折处未见有NOS的表达，骨折处也未见有bNOS的表达。iNOS和eNOS的表达情况略有不同：iNOS在骨折愈合各期都有表达闷天，l周，2周和4周入而eNOS在骨折愈合中的表达时期不同于iNOS门周和2周人并且它们的表达强度也有所不同。NOS主要在成纤维细胞、成软骨细胞和骨a的血管内皮中表达。与对照组相比，L－NAME组的骨折愈合程度要慢汗＝0．10L人－rs组与之相比并没有显著差异；将两个实验组比较，L－rs组的骨折愈合速度要强于 L－NxME组（P＜0．05）。 讨 论 NO是80年代逐渐被人们发现并认知的一种重要的信使分子和效应分子。NO在多个系统的生理病理过程中所起的重要作用不断被阐明，使NO的研究渗人到很多学科，成为生物医学领域的热点和前沿之一。NO在临床上也得到初步应用，关于NO在心血管、神经系统、肺部疾病、消化系统、器官移植以及骨关节疾病中作用的研究越来越深人。 我们通过实验证实了在骨折愈合中骨折断端和骨痴中有NOS的表达，说明在骨折时确实有NO产生，由此推断NO可能在骨折愈合中起一定的作用。但是，关于NO在骨折中的作用机制仍不十分清楚，目前已知其可能通过几个途径发挥作用：1．骨折愈合是一个涉及一系列细胞事件的过程，愈合过程需要血小板、伤口巨嗜细胞、成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞及破骨细胞等的参与，所有这些细胞都能表达iNOS。NO在骨折愈合中可能作为一种细胞因子直接发挥作用，也可能通过促进释放各种生长因子和细胞 ·3·因子，例如 BMP、b BGF、TGFp等发挥作用，而 BMP＊ BGF、eFp等在骨折愈合中作用已经得到广泛的证实。2．我们通过实验发现，eNOS在骨折后1周和2周时在骨折处的增生血管内表达。NO最初就是作为血管内皮生长因子被发现的，它被认为是最长效的血管扩张剂和各种病理生理条件下的血管增生调节剂。它通过血管内皮细胞与乙酚胆碱的反应而合成和释放，通过临近平滑肌细胞的松弛引起血管扩张。因为NO被认为与新生血管的信号偶联有关，在骨折愈合的骨痴形成阶段，它可能在已经存在的血管和?