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目的通过对HepG2细胞膜上乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)前S1区(preS1)结合蛋白的分离并进行质谱鉴定,以及对preS1与鉴定出的蛋白在细胞膜水平上和体外的相互作用进行研究,从而鉴定preS1在HepG2细胞膜上的结合蛋白,为继续深入探索乙型肝炎病毒的肝细胞膜受体进而揭示HBV的入侵机制打下基础。策略与方法1. HepG2细胞膜上preS1结合蛋白的分离:利用基因重组技术将HBV preS1基因与GST标签在原核表达系统中融合表达;以融合蛋白GST-preS1为探针蛋白,与生物素标记膜蛋白的HepG2全细胞裂解液孵育,利用pull down技术分离HepG2细胞膜上与preS1结合的蛋白。2.对分离出的preS1结合蛋白进行质谱鉴定:利用液相色谱/质谱联用离子阱质谱仪进行质谱分析,仪器根据质谱分析获得的肽序列谱图自动进行数据库搜索,采用Spectrum Mill proteomics software在SwissPort数据库中搜索针对人的序列,通过预设条件的筛选从而鉴定出相应蛋白。3.对鉴定出的蛋白进行原核表达:从数据库中获得目的蛋白的基因序列,利用基因重组技术将基因与His标签在原核表达系统中融合表达。4.用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)观察鉴定出的蛋白在HepG2细胞中的分布情况,采用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)技术检测细胞膜水平上preS1与鉴定蛋白的相互作用。5.通过体外结合试验进一步验证preS1与鉴定蛋白之间的相互作用。结果1.成功构建了重组表达质粒pGST-preS1,并在原核表达系统中进行诱导表达。采用亲和层析法对表达的GST-prerS1融合蛋白进行纯化,纯度在90%以上,GST-preS1可以与抗preS1(37-45aa)位点的特异性单抗结合,显示出良好的抗原性。2.以融合蛋白GST-preS1为探针蛋白,利用pull down技术,从HepG2细胞膜上分离到一分子量约为110kDa大小的蛋白条带(p110)。3.切取p110蛋白条带进行质谱分析,通过相应筛选鉴定出了两个蛋白:78 kDa glucose-regulated protein precursor(GRP78)与LanC-like protein 1(LANCL1)。4.成功构建了重组表达质粒pW28-GRP78与pW28-LANCL1,并在原核表达系统中进行诱导表达,采用亲和层析法对表达的His-GRP78与His-LANCL1融合蛋白进行纯化,纯度在95%以上,融合蛋白可以与各自的特异性抗体结合,显示出良好的抗原性。5.在激光扫描共聚焦显微镜下观察,可见GRP78均匀分布在HepG2细胞膜上,证实GRP78为膜蛋白成份。6. preS1与培养的HepG2细胞孵育后,激光扫描共聚焦显微镜下可见GRP78与preS1在细胞膜上的共定位,应用FRET技术证实了二者在细胞膜上的结合。7.通过体外结合试验,进一步证实了GRP78与preS1的相互作用。结论GRP78是HepG2细胞膜上与HBV包膜蛋白preS1区域结合的蛋白。通过本课题的研究,为继续深入探索乙型肝炎病毒的肝细胞膜受体进而揭示HBV的入侵机制打下了基础。