狂犬病病毒（RABV）是弹状病毒科狂犬病毒属的一种单股负链RNA病毒,能引起人和动物发生高度致死性狂犬病。病毒粒子由核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和大蛋白（L）组成。N、P、L蛋白包裹病毒RNA基因组构成核糖核蛋白复合物（RNPs）,N蛋白与基因组RNA结合,能够保护病毒RNA免于被降解;M蛋白与包膜下的RNPs相互作用,有助于病毒粒子组装;G蛋白能够识别细胞表面受体,在RABV与胞膜融合及胞内运输过程中起重要作用。尽管对RABV研究众多,但微管和马达分子对RABV胞内感染的影响还有待深入研究。本研究首先使用微管抑制剂Nocodazole预处理N2a细胞,然后进行RABV感染。分别采用RT-qPCR、Western blot检测RABV N基因及蛋白表达量,通过免疫荧光观察Nocodazole处理对RABV在N2a细胞的感染率及上清中病毒TCID₅₀滴度的影响,研究微管在RABV感染中的作用。随后N2a细胞感染RABV12 h后,用Nocodazole处理,收集不同处理时间样品,进行RT-qPCR、TCID₅₀检测,分析病毒出胞时间及微管对病毒出胞过程的影响。为验证dynein分子马达在RABV感染中的作用,通过特异性抑制剂Na₃VO₄处理或马达复合物亚基成分的重组质粒pcDNA4.0-myc-CC1和pcDNA3.1-flag-p50转染细胞,检测RABV N基因、蛋白表达量及上清病毒滴度,评价dynein在RABV感染中的作用。另外,还通过转染重组质粒pcDNA3.1-flag-KHCct,检测了分子马达kinesin-1在RABV感染中的作用。通过内质网标志蛋白CNX、PDI与RABV结构蛋白共定位来检验内质网是否参与RABV感染。结果显示,Nocodazole预处理抑制了微管形成,使RABV N基因拷贝数降低约25%、N蛋白降低约50%,病毒感染率降低约70%,上清液中病毒滴度由10^6.5TCID₅₀/mL下降至10^4.5TCID₅₀/mL,说明狂犬病病毒胞内感染依赖于微管骨架的参与。RABV感染后用微管抑制剂处理也得出相似结论。Na₃VO₄预处理抑制dynein,RABV N基因降低约60%、N蛋白降低约45%,病毒感染率降低约75%,上清病毒滴度由10^7.5TCID₅₀/mL降至10^5.5TCID₅₀/mL,说明狂犬病病毒胞内感染依赖于逆向运输分子马达dynein参与。重组质粒pcDNA4.0-myc-CC1、pcDNA3.1-flag-p50的表达均可竞争性抑制dynein功能,N基因分别降低约75%、40%,N蛋白降低约50%、70%,单细胞内病毒感染率均显著减少,上清液中病毒滴度分别由10^7.5TCID₅₀/mL降至10^5.5TCID₅₀/mL、10^7.0TCID₅₀/mL降至10^5.75TCID₅₀/mL。胞内转染重组质粒pcDNA3.1-flag-KHCct竞争性抑制了kinesin-1功能,RABV N基因降低约25%、N蛋白降低约25%,细胞内病毒感染显著减少,上清病毒滴度由10^6.75TCID₅₀/mL降至10^5.5TCID₅₀/mL,证明RABV胞内感染也依赖于分子马达kinesin-1。应用抗RABV G蛋白抗体染色,发现ER标志蛋白CNX、PDI与RABV G蛋白有明显共定位。进一步检测发现,RABV P蛋白也与ER标志蛋白CNX、PDI有明显共定位。以上结果表明,RABV感染N2a细胞需要微管及马达分子dynein、kinesin-1运输系统的参与,其中以dynein的作用更大。初步结果显示,内质网参与RABV G蛋白、P蛋白的胞内复制。本实验为进一步研究RABV胞内感染及装配细节奠定了基础。