目的：　　 观察内皮祖细胞(EPC)在不同浓度血管内皮生长因子(VEGF)作用下的生物学特性,探讨VEGF对EPC生物学特性的影响。　　 方法：　　 无菌条件下分离胫骨和股骨,M199培养液冲洗骨髓腔,收集冲洗液充分吹打混匀,加入装有密度梯度为1.077 g/cm3的淋巴细胞分离液的离心管,冲洗液与分离液的体积比为2∶1。20℃下2000r/minFicoll-Histopaque梯度离心沉淀20min。吸取中间乳白色云雾状单个核细胞层,PBS冲洗细胞沉淀。以1×106/ml的密度接种到100ml培养瓶中。含20％胎牛血清的M199培养基,37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养。48h后重新接种未贴壁细胞。第3天半量换液,第5天全量换液。细胞达到80％以上融合时,用0.25％胰酶(含1％EDTA)消化细胞。在第7天运用流式细胞仪行细胞表型CD133、CD34鉴定。收集贴壁细胞并计数,将等量EPC悬液200μl接种到96孔培养板,继续培养2d,用不含胎牛血清的M199培养液培养24h后,换含有不同浓度(0、10、50ng/ml)VEGF的培养液,每个浓度组重复5孔,培养24h后,每孔加MTT(5 g/L)20μl,继续培养4h后,吸弃上清液,再加入DMSO(150μl/孔),水平振荡10min后置于酶标仪波长560nm处,取5个孔吸光值(optical density OD)的平均值,得到最适浓度。以最适浓度按上述方法培养,以培养时间为横坐标、OD值为纵坐标,绘制细胞生长曲线。应用24孔的Transwell(孔径8μm)小室行体外迁移实验。上室为200μl EPC(1×104/ml)悬液,下室为含不同浓度(0、10、50 ng/ml)VEGF的M199培养液。37℃下培养24h,将上室附着细胞用湿棉签擦去,固定,Giemsa染色,脱色,拍照(×200),实验重复3次。倒置显微镜计数迁移细胞。体外血管生成能力检测:应用纤维蛋白凝胶行体外血管生成实验。96孔培养板每孔依次加30μl人纤维蛋白原与20μl凝血酶,晃匀,37℃30min成凝胶;加入5×103细胞悬液培养过夜;去除培养液,依次加30μl人纤维蛋白原与20μl凝血酶,晃匀,加100μl培养液,24h。显微镜观察血管生成,随机选取3个视野(×200)计数血管数目。原代细胞培养至第4天时,换用含不同浓度(10和50ng/ml)VEGF的M199培养液,培养1d后,运用流式细胞仪进行检测。将贴壁细胞用胰酶消化后,PBS反复吹打制成单细胞悬液,2000r/min离心5min,将细胞置于50μlPBS中,制成单细胞悬液。加入CD31直标抗体,4℃孵育60min。PBS洗涤重悬后立即在避光条件下进行流式细胞检测,计数1×104个细胞。同型对照一抗为PBS,其余操作同上。统计CD31+细胞的百分率,应用WinMDI2.9软件进行分析。　　 结果：　　 培养7d的细胞CD133和CD34阳性率分别为69.44％和81.0596。MTT实验显示,10ng/ml组细胞的OD值明显大于0ng/ml组和50ng/ml组,0ng/ml组的OD值明显大于50ng/ml组(P＜0.05);迁移实验、体外血管形成实验及诱导分化实验显示,50ng/ml组和10ng/ml组较0ng/ml组更能促进EPC的迁移、体外血管形成及诱导分化,且50ng/ml组强于10ng/ml组(P＜0.05)。　　 结论：　　 VEGF能够提高EPC迁移能力、体外血管形成能力及促进诱导分化,且随着VEGF浓度的升高而增强。VEGF能够提高EPC增殖能力,但随着浓度的升高而减弱。