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香茅醛是一种无环单萜醛。由于香茅醛分子里有一个不对称碳原子,故多以(R/S)-香茅醛混合物的形式出现,其中(R)-香茅醛可以合成天然维生素E、是药物合成中间体,也是世界三大香料之一L-薄荷醇合成的关键中间体。目前(R)-香茅醛合成主要有化学法和生物法。(R)-香茅醛工业合成主要应用日本高砂(Takasago)公司和德国巴斯夫(BASF)发明的化学合成法。但是化学法存在催化剂回收利用困难等困难。相比之下,生物法由于环境友好等特点正逐渐应用于(R)-香茅醛的生产。生物法中烯醇还原酶是应用最广泛,研究最多的生物催化剂。烯醇还原酶能在辅酶NAD(P)H的存在下对柠檬醛的碳碳双键进行反式加氢生成香茅醛。但野生烯醇还原酶对(R)-香茅醛的合成有立体选择性不高和活力不足的问题。因此在本研究中,我们选择以Sacchromyces.cerevisiae S288C老黄酶OYE3为研究对象,为了提高老黄酶OYE3在(R)-香茅醛合成中的应用,我们做了以下几方面工作:1.基于对老黄酶OYE3结构和其催化机理的了解,使用半理性设计对老黄酶OYE3进行了改造,得到了具有高立体选择性的突变酶;2.对该突变酶的催化条件进行优化,提高其在(R)-香茅醛合成中的产物得率;3.利用融合酶技术将老黄酶OYE3与GDH融合在一起促进辅酶循环,使融合酶能够催化高浓度(E)-柠檬醛。首先通过半理性设计改造老黄酶OYE3,实现对(R)-香茅醛的高选择性合成。选择老黄酶OYE3催化口袋周围loop区域氨基酸,以及同类型酶中的对映选择性位点进行定点突变。在所有的突变体中,S296F和W116A催化(E)-柠檬醛时具有高立体选择性(>99%),而催化(Z)-柠檬醛时产物构型出现了逆转(从(S)-到(R)-)。通过同源建模与分子对接发现,S296F和W116A与底物(Z)-柠檬醛的结合模式发生了“翻转”,与实验结果相符合。后通过替代氨基酸优化得到了S296F、W116G等具有高立体选择性的突变酶。最后经过组合突变,得到了选择性催化(E)-柠檬醛而不催化(Z)-柠檬醛的老黄酶OYE3的突变酶S296F/W116G。由于突变酶S296F/W116G在具备高立体选择性的同时催化活力较低,因此通过催化条件优化提高其在(R)-香茅醛合成中的催化效率。通过单一变量法探究温度、p H、辅酶NADP~+浓度、辅底物D-葡萄糖浓度、GDH与S296F/W116G酶活添加比例等条件对(E)-柠檬醛催化结果的影响。然后向反应中分别添加20种氨基酸来偶联柠檬醛异构化反应,提高(Z)-柠檬醛利用效率,并探究氨基酸浓度对催化结果的影响。最终实验结果表明在30℃、p H 7.0、NADP~+0.4 m M、D-葡萄糖60 m M、GDH:S296F/W116G=1:1,添加0.5 M丝氨酸条件下,突变酶S296F/W116G催化10 m M(E)-柠檬醛的产物得率从41.31%提高到了58.64%,催化10 m M(Z)-柠檬醛的产物得率从0提高到55.85%,而催化10 m M(E/Z)-柠檬醛时产物得率则从23.53%提高到48.74%。考虑到老黄酶OYE3及其突变酶可催化柠檬醛浓度较低,在(R)-香茅醛合成中的限制,我们将老黄酶OYE3与葡萄糖脱氢酶GDH通过连接肽连接到同一个载体上,构建双酶共表达系统以促进辅酶循环,提高底物转化率。在催化100m M(E)-柠檬醛的实验中,融合酶表达菌E.coli BL21(DE3)/p ET28b-GDH-(GSG)-OYE3和E.coli BL21(DE3)/p ET28b-GDH-(GSG)-S296F催化结果中产物得率分别达到>99%和93.98%,而产物e.e.值明显下降。E.coli BL21(DE3)/p ET28b-GDH-(GSG)-S296F/W116G融合酶表达菌催化产物e.e.值达到83.53%但产物得率只有36.96%。因此推断,酶融合表达会改变单酶与底物结合模式从而影响产物构型。此外,相比于单表达菌,融合表达菌的催化产物中几乎没有香茅醇等副产物生成。