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牙周膜成纤维细胞是牙周膜的主要细胞类型,它在牙周组织的再生、完整性维持和功能实施过程中发挥重要作用。白介素-17(interleukin-17,IL-17)是目前发现的CD4+T细胞新亚群Th17及其它免疫细胞分泌的一种独特性细胞因子,能够刺激成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和基质细胞等产生多种效应分子发挥广泛的生物学作用。目前研究发现IL-17能通过诱导多种基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases, MMPs)表达从而介导炎症反应、自身免疫与组织改建过程。MMPs是降解牙周支持组织中细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的重要酶类之一,它与基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP)相互作用,协调ECM降解与重建,维持牙周组织结构的完整性和内环境稳定,其中MMP-1在细胞迁移和胞外基质的病理修复过程中发挥关键作用。此外,细胞迁移过程还涉及一系列细胞骨架调控蛋白的合成及重组。但目前IL-17对MMP-1调节方式及其参与调节细胞迁移的分子机制尚未完全明确,,我们推测IL-17可能通过调控牙周膜成纤维细胞表达MMP-1参与牙周组织改建过程。本课题拟通过体外实验探讨IL-17介导牙周膜细胞表达MMPs及调节细胞迁移的作用方式,并观察人及大鼠根尖周病损中IL-17及MMP-1的相互关系,分析两者在根尖周炎病理过程中的作用。第一部分：IL-17调控人牙周膜成纤维细胞表达MMPs及依赖的信号通路研究实验一：IL-17调控人牙周膜成纤维细胞表达MMPs研究目的：初步探讨IL-17对人牙周膜成纤维细胞表达MMPs、TIMP-1及EMPPRIN的调节作用。方法：体外培养人牙周膜成纤维细胞,RT-PCR、实时定量RT-PCR、ELISA和明胶酶谱法检测牙周膜成纤维细胞受到IL-17刺激后MMPs、TIMP-1及EMPPRIN的mRNA和蛋白表达水平。结果：原代培养的人牙周膜成纤维细胞经鉴定证实为中胚层来源。IL-17刺激牙周膜细胞后能显著上调MMP-1和MMP-13的mRNA表达及蛋白分泌水平,同时下调MMP-2、MMP-9和TIMP-1的nRNA表达和蛋白分泌水平。不过,IL-17对EMMPRIN的mRNA表达及蛋白分泌水平无调控作用。结论：IL-17能调控人牙周膜细胞差异性表达MMPs和TIMP-1,推测这一现象可能参与牙周炎症及组织改建过程。实验二：IL-17调控人牙周膜成纤维细胞表达MMP-1及所依赖的信号通路研究目的：观察IL-17调控人牙周膜细胞表达MMP-1的作用机制,探讨其所依赖的信号通路。方法：体外培养人牙周膜细胞,实时定量RT-PCR、ELISA和Western blotting观察IL-17刺激后MMP-1的mRNA和蛋白活性的表达水平；细胞免疫荧光染色定位人牙周膜细胞表达MMP-1的情况；Western blot检测IL-17激活的信号通路情况；采用信号通路抑制剂和RNA沉默技术筛选参与IL-17介导MMP-1表达上调的信号通路分子；凝胶电泳迁移率实验检测转录蛋白和目的基因的相互作用。结果：IL-17刺激牙周膜细胞上调MMP-1的mRNA和蛋白表达水平呈时间-浓度依赖性,且MMP-1前体和活性成分的表达强度均升高。IL-17受体的中和抗体可阻断IL-17介导的MMP-1高表达。IL-17刺激牙周膜细胞后,p38-MAPK、 ERK1/2、JNK及Akt等信号激酶发生磷酸化,胞内NF-κBp65发生核转位。在IL-17刺激牙周膜细胞前用各种信号通路抑制剂预处理,发现p38-MAPK抑制剂(SB203580)和NF-κB抑制剂(PDTC)预处理后MMP-1的表达水平降低。细胞转染p38α siRNA能抑制IL-17介导的MMP-1高表达。此外,p38α siRNA还能抑制IL-17诱导后的NF-κB转核及与目的基因的结合力。结论：IL-17诱导牙周膜细胞表达MMP-1依赖IL-17与IL-17R的相互作用,及p38-MAPK/NF-κB信号通路。第二部分：IL-17调节人牙周膜细胞迁移及其作用方式的研究实验三：IL-17调节人牙周膜细胞迁移及其作用方式的研究目的：观察IL-17对牙周膜细胞增值及迁移的影响,检测IL-17调节牙周膜细胞内骨架的改变,探讨影响牙周膜细胞迁移的信号通路。方法：体外培养人牙周膜细胞,CKK-8和划痕实验分别检测IL-17诱导牙周膜细胞的增值和迁移情况；加入IL-17受体的中和抗体、TIMP-1、转染MMP-1siRNA或p38α siRNA检测IL-17介导细胞迁移的变化；细胞染色定位IL-17刺激前后细胞内纤维状肌动蛋白(F-actin)形成和胞内骨架变化；免疫荧光双染共定位磷酸化paxillin和F-actin的位置及分布；Western blotting检测IL-17激活的粘附斑激酶(FAK)磷酸化情况。结果：IL-17刺激能促进牙周膜细胞迁移但对细胞增值无影响。加入IL-17受体的中和抗体、TIMP-1、转染MMP-1siRNA或p38α siRNA均能抑制IL-17介导下的细胞迁移。IL-17能促进细胞内骨架改建,包括F-actin骨架重排、肌应力纤维束形成及板状伪足伸出,这一过程能被MMP-1siRNA和p38抑制剂所阻断。此外,IL-17还能促进细胞磷酸化paxillin向细胞膜和肌动蛋白细丝顶端移动聚集以及激活粘附斑激酶(FAK)磷酸化。当加入p38抑制剂后IL-17介导下的细胞内骨架改建和磷酸化paxillin组装受到抑制。结论：IL-17促进牙周膜细胞迁移依赖p38-MAPK活化的MMP-1高表达,迁移过程中IL-17介导的细胞骨架和粘附斑重组需要MMP-1的参与；FAK磷酸化和p38-MAPK共同调节黏着斑的分布组装,IL-17可能通过调控p38-MAPK、FAK和MMP-1参与的细胞骨架改建最终导致牙周膜细胞的迁移。第三部分：IL-17和MMP-1在人及大鼠根尖周病变的表达情况研究实验四：IL-17和MMP-1在人慢性根尖周病变的表达情况研究目的：检测在人慢性根尖周病变IL-17和MMP-1的表达情况,分析两者表达的相互关系。方法：从2013年1月至8月在武汉大学口腔医院牙体牙髓科行根尖手术或颌面外科拔牙患者中,收集到人慢性根尖周炎病损组织15例(其中根尖周肉芽肿10例,囊肿5例)及正常根尖周组织标本4例。7例根尖周病损标本用于组织学、免疫组化和免疫荧光染色研究,以观察IL-17和MMP-1的表达情况。另外8例根尖周病损标本及4例正常根尖周组织标本采用实时定量RT-PCR方法检测IL-17和MMP-1mRNA表达,并分析IL-17与MMP-1表达量之间的关系。结果：免疫组化结果显示IL-17和MMP-1均表达于人慢性根尖周肉芽肿及囊肿中。免疫荧光染色指示表达IL-17与MMP-1的细胞存在不同,前者主要定位于淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞等,后者除定位于炎性细胞外,还(?)成纤维样细胞和血管内皮细胞上表达。此外,实时定量RT-PCR结果发现在两者mRNA的表达水平均高于正常对照组,且IL-17在根尖肉芽肿的表达量稍高于根尖周囊肿,而MMP-1在根尖周囊肿的表达量则略高,但无统计学意义,IL-17表达与MMP-1表达呈正相关。结论：IL-17与MMP-1共同参与根尖周炎慢性期炎症,提示两者参与了慢性炎症的发展过程。实验五：IL-17和MMP-1在大鼠根尖周病变的表达情况研究目的：检测在大鼠根尖周病变IL-17和MMP-1的表达情况,探讨两者在病变发展过程中的相互关系。方法:将30成年雄性Sprague-Dawle大鼠开髓,分别于术后0、7、14、21、28和35天取下颌骨,制备组织切片。HE染色观察根尖周病变中炎症变化：免疫组织化学检测IL-17和MMP-1的表达与变化,并用胶原染色分析根尖周基质纤维变化。结果：在大鼠根尖周炎模型中,正常组根尖周组织未见炎性细胞和IL-17及MMP-1阳性细胞,胶原纤维排列整齐；术后7天组根尖周可见少量炎性细胞浸润,并有少量IL-17阳性细胞和MMP-1阳性细胞出现；术后14天IL-17阳性细胞和MMP-1阳性细胞增多,胶原结构紊乱；术后21～28天,IL-17的表达量继续增加,至21天达到峰值,MMP-1阳性细胞和中性粒细胞也持续增加；术后28-35天,IL-17及MMP-1阳性细胞数量恒定,有新生胶原合成,根尖周炎症进入慢性期阶段。IL-17阳性细胞和MMP-1阳性细胞数与根尖周炎进展相关,且IL-17和MMP-1的表达呈正相关。结论：IL-17与MMP-1共同参与根尖周炎急性及慢性期炎症,提示两者在疾病的发生、发展及转归等病理过程中的起到一定作用。