咪达唑仑(Midazolam)是短效水溶性苯二氮卓类药物,能迅速进入中枢神经系统,作用于GABAA受体,通过易化GABA介导的氯离子内流而抑制神经信号的传递,产生抗焦虑、镇静、催眠、抗惊厥、肌松、顺行性遗忘等作用。咪达唑仑作为镇静和抗惊厥药在麻醉和监护病房有广泛的应用。　　研究发现,咪达唑仑具有双靶标药物特性,不仅作用于GABAA受体,同时也是线粒体转位蛋白(Mitochondrial Translocator Protein, TSPO,18kDa转位蛋白,在中枢神经系统主要分布于神经胶质细胞线粒体外膜,主要功能是将线粒体外膜的胆固醇转运进入线粒体内膜)受体激动剂,与神经胶质细胞线粒体外膜转位蛋白TSPO结合后能够加强内源性神经甾体如孕酮、孕烯醇酮、雌激素及睾酮等的合成,而内源性神经甾体广泛参与焦虑、抑郁等应激情绪反应的调控,也与学习记忆、惊厥、睡眠、进食、神经再生,神经保护等机制的调节有关,但详细机制尚不清楚。　　本研究拟通过在体动物及离体细胞两种途径分别探讨一、咪达唑仑对大鼠手术创伤后认知功能的影响及其机制;二、咪达唑仑对高浓度皮质酮损伤的星形胶质细胞是否有细胞保护作用及其可能机制。　　第一部分咪达唑仑对大鼠手术创伤后认知功能的影响及其机制　　目的:以脾切除术后大鼠为手术应激创伤模型,探讨咪达唑仑对手术创伤后大鼠认知功能的影响及其可能机制。　　方法:SD雄性大鼠随机分为四组,对照组10只(C组,皮下注射等体积生理盐水,30min后接受2％戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射全麻一次);咪达唑仑组30只(M组,皮下注射咪达唑仑2 mg/kg,30min后接受2%戊巴比妥钠30mg/kg全麻一次);手术组30只(S组,皮下注射等体积生理盐水,30min后在2%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射全麻下行脾切除术);咪达唑仑+手术组30只(MS组,皮下注射咪达唑仑2 mg/kg,30min后在2%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射全麻下行脾切除术)。术前用Morris水迷宫定位航行实验(Positioning navigation)评价各组大鼠学习认知功能,术后用Morris水迷宫空间探索实验(Probe test)评价其认知功能。所有组别大鼠在手术前5天均接受定位航行训练实验,方法为每天4次,寻找隐藏在水迷宫水平面下固定的隐藏平台。第6天接受脾切除术,术后第1,3和7天用“空间探索实验”评价其空间记忆和认知功能,并记录穿台次数和目标象限停留时间。用酶联免疫法(ELISA)检测术后各组大鼠海马皮质酮、孕酮、以及促炎因子IL-1β、IL-6含量,用免疫荧光组织学方法测定术后各组大鼠海马组织切片星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白( glial fibrillary acidic protein,GFAP)及转位蛋白TSPO的表达。　　结果:1.定位航行训练实验各组大鼠训练5天后,寻找平台的潜伏期明显缩短,三天后各组之间上台潜伏期无统计学意义。2.空间探索实验 M组大鼠在术后各时间点其目标象限的停留时间和穿台次数与C组相比无显著差异(P>0.05);与C组相比,S组大鼠于术后第1和第3天目标象限的停留时间缩短(P﹤0.05),穿台次数减少(P﹤0.05);MS组与S组大鼠在术后第1和第3天相比较,MS组大鼠目标象限的停留时间延长(P﹤0.05);穿台次数增加(P﹤0.05);术后第7天,各组在目标象限停留时间与穿台次数与对照组相比P>0.05,均无统计学意义。3. ELISA结果显示,术后第一天,S组、MS组与C组相比,其海马皮质酮含量明显增高(P﹤0.001),孕酮含量显著下降(P﹤0.001),而白介素1和白介素6含量均显著升高。MS组与S组相比,其海马皮质酮含量显著降低(P﹤0.001),孕酮含量升高(P﹤0.05),而白介素1和白介素6含量均显著降低(P﹤0.001);术后第三天,S组、MS组与C组相比,其海马皮质酮及白介素6含量均显著增高,只有S组孕酮含量较C组降低,MS组与C组比较无显著差异,白介素1在各组之间均无显著差异。MS组与S组相比,皮质酮及白介素6含量降低(P﹤0.01),孕酮含量虽有增高,但无统计学差异。术后七天,各组皮质酮、孕酮、白介素1、白介素6含量与C组相比均无显著差异。术后1、3、7天M组与C组比较,其海马皮质酮、孕酮及白介素1、白介素6含量均无显著差异。4.免疫荧光组织学方法测定术后第一天,与C组比较,S组纤维酸性蛋白(GFAP)表达增高,转位蛋白(TSPO)表达降低,MS组纤维酸性蛋白与转位蛋白表达均增高。MS组与S组比较,纤维酸性蛋白表达无显著差异,但转位蛋白表达显著增高。术后第三天,与C组比较,S组纤维酸性蛋白表达增高,转位蛋白TSPO表达降低,MS组与S组比较,纤维酸性蛋白表达无显著差异,但转位蛋白表达显著增高。术后第七天,S组纤维酸性蛋白与转位蛋白表达与C组比较均无显著差异,MS组与S组比较,纤维酸性蛋白与转位蛋白TSPO表达无显著差异。　　结论:咪达唑仑可改善手术创伤应激对大鼠造成的早期认知功能损害,其机制可能是咪达唑仑抑制手术创伤引起的应激激素的升高,促进海马星形胶质细胞线粒体膜TSPO蛋白合成,后者促进神经甾体孕酮的产生,从而产生神经保护作用有关。　　第二部分咪达唑仑对皮质酮诱导损伤星形胶质细胞的保护作用及其机制　　目的:研究咪达唑仑对皮质酮损伤的星形胶质细胞是否具有保护作用及其机制。　　方法:以大鼠大脑的神经胶质细胞为研究对象,通过放射性配体竞争结合试验,研究咪达唑仑对神经胶质细胞线粒体外膜 TSPO转位蛋白的亲和力。以体外纯化培养的星形胶质细胞为对象,通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养液中孕烯醇酮及孕酮含量,研究咪达唑仑对星形胶质细胞合成神经甾体孕烯醇酮及孕酮的影响。然后以高浓度皮质酮损伤的星形胶质细胞为模型,通过CCK8及ATP实验测定星形胶质细胞活力,研究咪达唑仑、孕烯醇酮及孕酮对皮质酮损伤的星形胶质细胞是否有保护作用,这种保护作用是否可被合成神经甾体孕酮的关键酶曲洛司坦所阻断。　　结果:研究发现,与TSPO的高亲配体Ac-5216相比,咪达唑仑与星形胶质细胞的亲和力较弱。在浓度为10-4M至10-5M的范围内,咪达唑仑与TSPO结合率约20-30%。咪达唑仑可以剂量相关的促进星形胶质细胞合成分泌神经甾体孕烯醇酮及孕酮。咪达唑仑与孕酮对皮质酮损伤的大鼠星形胶质细胞都有一定的细胞保护作用。但孕烯醇酮的保护作用则较弱。咪达唑仑的此种保护作用与剂量相关,并且可被合成神经甾体孕酮的特异性阻断剂曲洛司坦所阻断。　　结论:咪达唑仑可能通过作用星形胶质细胞线粒体膜相关的TSPO受体,促进胆固醇的转运,从而加强神经活性甾体孕烯醇酮及孕酮的合成。咪达唑仑对皮质酮损伤的星形胶质细胞具有细胞保护作用,从而避免在急性或慢性应急状态下高浓度皮质酮对星形胶质细胞的损伤。这种保护作用可能部分是通过咪达唑仑作用于星形胶质细胞线粒体膜的TSPO转位蛋白,加速类固醇的跨膜转运,促进了神经甾体孕酮的合成,从而通过孕酮产生了细胞保护作用。