第一部分消退素D1对脂多糖诱导的小鼠中枢神经系统炎症反应的影响目的：研究消退素D1(resolvin D1, RvD1)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的小鼠中枢神经系统炎症介质的表达,小胶质细胞激活,以及核因子κB (nuclear factor-kappaB,NF-κB)通路活化的影响,以探讨RvD1对脂多糖诱导的小鼠中枢神经系统炎症的影响及可能的机制。方法：健康雄性C57BL/6小鼠100只,8-12周,随机分为五组：(1)对照组：腹腔和侧脑室注射等体积生理盐水；(2)LPS组：侧脑室给予2μ1生理盐水后；立即腹腔注射LPS250μg/kg (100μl);(3)RvD1小剂量组：侧脑室给予RvD11ng (2μl)后立即腹腔注射LPS;(4) RvD1大剂量组：侧脑室给予RvD110ng (2μl)后立即腹腔注射LPS；(5)拮抗剂组：侧脑室给予甲酰肽受体(formyl-peptide receptor, FPR)拮抗剂Boc-21μg+RvD110ng (2μl)后立即腹腔注射LPS。4小时后,过量麻醉处死小鼠,免疫组化染色观察小胶质细胞标志物离子钙接头蛋白分子-1(ionized calcium bindingadaptor molecule-1,Iba-1)阳性细胞；ELISA法检测小鼠血清、皮质以及海马中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)和白介素-1β (interleukin-1beta, IL-1β)浓度；Western blot检测皮质以及海马组织IKB-α和胞核内NF-κB p65亚基的表达；电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)检测皮质和海马组织中NF-κB DNA结合活性。结果：与对照组相比,LPS组血清、皮质以及海马炎症因子TNF-α和IL-1β浓度明显增高,小胶质细胞激活。侧脑室注射RvDl对血清TNF-α和IL-1p浓度无显著影响,但RvD110ng可以抑制LPS引起的皮质和海马TNF-a和IL-1p浓度升高和小胶质细胞激活,RvD11ng无显著效果。LPS还可引起皮质和海马IκBα蛋白降解,胞核NF-κB p65表达增加以及NFκB DNA结合活性的增加；RvD10ng侧脑室给予可以抑制LPS引起的IκBα和NF-κB活化。FPR2拮抗剂Boc-2可以阻断RvD1的作用。结论：RvDl可降低LPS引起的神经系统炎性因子TNFa和IL-1p的产生,其抗炎作用是通过与FPR2结合进而抑制NF-κB信号通路实现的。第二部分消退素D1对脂多糖诱导的小胶质细胞M1极化的影响目的：小胶质细胞存在两种极化的激活方式：M1极化(经典活化)和M2极化(选择性活化)。M1极化的小胶质细胞表达促炎症因子,如TNF-α、IL-1β和一氧化氮(nitric oxide, NO)。该部分研究RvD1对LPS诱导的小胶质细胞M1极化及其相关信号通路的影响,以探讨RvDl在神经系统发挥抗炎作用的机制。方法：体外培养的小鼠BV-2小胶质细胞株,分为五组：(1)对照组；(2)RvD1组：用不同浓度的RvD1(0.1nM、1nM、10nM、100nM)处理;(3)LPS组：用100ng/ml LPS处理;(4)RvDl+LPS组：不同浓度的RvD1(0.1nM、1nM、10nM、100nM)处理后30min后加入LPS处理；(5)拮抗剂组：在用RvD1和LPS处理前用10μM/LBoc-2处理30mmino采用MTT法检测细胞活力,ELISA检测培养上清中TNF-α和IL-1p浓度；硝酸还原酶法检测培养上清中NO浓度；Western blot检测小胶质细胞诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)表达,胞核NF-κB p65亚基表达,IκB-α蛋白的降解,细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase, ERK)、p38以及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化水平；免疫荧光观察p65细胞内定位；EMSA检测NF-κB以及激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)的DNA结合活性。结果：使用浓度的LPS和RvDl对BV-2细胞活力无显著影响。LPS可引起培养上清中TNF-α、IL-1β、NO浓度增高,iNOS表达增加,RvD11nM、10nM、100nM可降低TNF-α和IL-1p浓度。100nM RvD1可减少LPS诱导产生的NO和iNOS。100nMRvD1还可以抑制LPS刺激引起的IκB-α降解,p65核转位,抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)ERK1/2、p38、JNK蛋白的磷酸化,并抑制LPS引起的NF-κB以及AP-1DNA结合活性的增加。Boc-2可阻断RvDl的作用。结论：RvD1可抑制LPS诱导的小胶质细胞M1极化而发挥抗炎作用,该作用可能与抑制NF-κB和MAPK/AP-1通路激活有关。第三部分消退素D1对白介素-4诱导的小胶质细胞M2极化的影响目的：小胶质细胞存在两种极化的激活方式：M1极化(经典活化)和M2极化(选择性活化)。M2小胶质细胞主要介导炎症消退以及组织修复。本部分主要研究RvDl对白介素-4(interleukin-4,IL-4)诱导的小胶质细胞M2极化及其相关信号通路的影响,以探讨RvD1在神经系统中发挥抗炎促消退作用的机制。方法：体外培养的小鼠BV-2小胶质细胞株,分为五组：(1)对照组；(2)RvD1组：用100nM RvD1处理；(3)IL-4组：用10ng/ml IL-4处理;(4)RvD1+IL-4组：100nMRvDl处理30min后加入终浓度为10ng/ml的IL-4；(5)拮抗剂组：在用RvD1和IL-4处理前用10μMBoc-2或100μM来氟米特或1μMGW9662处理30min。采用Western blot和免疫荧光检测小胶质细胞M2标志物精氨酸酶-1(Arginase1,Arg1)和几丁质酶-3样蛋白-3(Chitinase3-like3,Ym1)蛋白表达；免疫荧光观察胞核过氧化物酶增殖活化受体-gamma(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARy)细胞内定位；Western blot检测信号转导和转录激活因子-6(signal transducer and activator of transcription-6,STAT6)磷酸化水平以及PPARγ表达水平,EMSA检测STAT6和PPARγ的DNA结合活性。为进一步确定FPR2、STAT6和PPARγ在RvD1和IL-4诱导的小胶质细胞选择性活化中的作用,我们使用Boc-2或来氟米特或GW9662阻断相应的受体或者通路,观察BV-2细胞Argl和Yml表达。结果：IL-4刺激引起小胶质细胞M2标志物Argl和Yml表达增多,STAT6磷酸化,胞核PPARγ表达增加以及STAT6和PPARγ DNA结合活性增加。RvD1预处理可进一步增加Argl和Yml表达,提高STAT6磷酸化水平、细胞核内PPARγ表达水平以及STAT6和PPARγ的DNA结合活性。Boc-2可拮抗RvDl的作用。阻断STAT6可抑制RvD1和IL-4引起的胞核PPARγ表达和DNA结合活力增加。阻断STAT6或PPARγ可消除RvD1和IL-4诱导的M2标志物Argl和Yml表达。结论：RvDl可促进IL-4诱导的小胶质细胞M2极化,从而发挥抗炎促消退作用,其作用是通过与FPR2结合进而促进STAT6/PPARγ信号通路激活实现的。