背景骨肉瘤是人类最常见的原发性骨肿瘤。骨肉瘤恶性程度高,容易出现组织浸润和远处转移。近年来,随着手术技术、放化疗等医疗技术的发展,目前骨肉瘤的治疗多采用新辅助化疗联合保肢手术的综合性治疗。外科手术联合辅助化疗已使大多数无远处转移骨肉瘤患者的治愈率大大提高。但对于已经出现转移的骨肉瘤患者,虽然辅助化疗效果比较显著,但仍易出现肿瘤局部复发、恶化以及远处转移,导致患者预后差,5年生存率显著降低。因此,寻找靶向性更高、更加安全有效的治疗手段以控制骨肉瘤的转移,是骨肉瘤治疗的迫切要求。MiRNAs是一类具有高度遗传稳定性、高度保守的内源性非编码单链小RNA,长度约为18～25bp。通过互补配对结合至靶基因mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)后,使靶基因mRNA发生降解,或者抑制靶基因mRNA的翻译过程,从而在转录后的表达水平对靶基因进行负向调控,进而参与调控各种复杂的细胞活动。研究表明,miRNAs的异常表达与骨肉瘤的增殖、转移和预后等生物学行为具有密切联系。例如,miR-199a-3p在骨肉瘤细胞中表达显著下调,如果上调其在骨肉瘤细胞中的表达,则可抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移;miR-21也参与骨肉瘤的发生和发展,其在人骨肉瘤组织显著高表达,通过调控RECK,可以促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭;miR-195可通过负向调控脂肪酸合成酶的表达,从而抑制骨肉瘤细胞系的迁移和侵袭。目前认为miRNA参与了肿瘤上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。EMT被认为是肿瘤细胞发生侵袭转移的第一步,也是至关重要的一步。EMT主要表现为上皮细胞间失去紧密连接、细胞骨架重排、上皮细胞性标志物E-cadheirn减少、间质细胞性标志物N-cadherin和vimentin增多等,这些特点使肿瘤细胞的迁移能力得到了增强。MiR-145在多种组织中广泛表达,被认为是一种肿瘤的抑制基因。目前已在多种肿瘤组织中发现miR-145呈低水平表达,如前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌等。miR-145可以通过与IRS-1基因的3’-UTR结合来下调IRS-1蛋白,从而抑制肿瘤细胞生长;通过直接作用于c-Myc,使肿瘤细胞阻滞于G1期,抑制细胞生长、促进细胞凋亡;通过下调RTKN,降低Rho的GTP结合活性,抑制细胞增殖。最新的研究发现miR-145不仅能够抑制肿瘤生长,而且能够抑制肿瘤细胞侵袭转移。研究目的1.揭示miR-145骨肉瘤组织和细胞系中的表达水平;2.研究miR-145对骨肉瘤细胞系侵袭转移和EMT发生的影响;3.阐明miR-145参与骨肉瘤EMT发生的分子机制。研究方法第一部分miR-145在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系中表达1.收集15例骨肉瘤组织和对应癌旁正常组织标本。2.荧光定量RT-PCR检测miR-145在15例骨肉瘤组织和对应癌旁正常组织标本中的表达水平。3.荧光定量RT-PCR检测miR-145在3种骨肉瘤细胞系U20S、MG63和SAOS2和正常人成骨细胞系hFOB中的表达水平。4.利用在先预测靶基因软件 Targetscan7.0(http://www.targetscan.org/)和PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)预测 miR-145 可能的靶基因。5.荧光定量RT-PCR和免疫组化检测NEDD9在骨肉瘤组织和对应癌旁正常组织标本中的表达。6.利用Pearson法对骨肉瘤组织中miR-145和NEDD9的表达进行相关性分析。第二部分miR-145对骨肉瘤细胞侵袭转移和EMT发生的影响1.合成miR-145 mimics,利用Lipofectamine 2000转染至骨肉瘤细胞系MG63,以转染miRNAnegative control及未转染细胞分别作为阴性对照和空白对照。2.利用荧光定量RT-PCR检测转染后48h各组细胞miR-145 mRNA的水平。3.利用CCK8实验检测转染后细胞增殖能力的变化。4.利用Boyden Chamber侵袭小室实验检测转染后48h各组细胞的侵袭能力。5.利用划痕实验检测转染后48h各组细胞的迁移能力。6.利用荧光定量RT-PCR检测转染后48h各组细胞Snaill、E-cadherin、vimentin和 N-cadherin mRNA 的表达。7.利用 Western blot 检测转染后 48h 各组细胞 Snaill、E-cadherin、vimentin 和N-cadherin蛋白的表达。8.将转染miR-145 mimics的骨肉瘤细胞系MG63接种至裸鼠腋下部位,观察裸鼠移植瘤生长情况,以转染miRNA negative control及未转染细胞分别作为阴性对照和空白对照。9.利用荧光定量RT-PCR检测并比较各组瘤组织中Snail 1、E-cadherin、vimentin和 N-cadherin 的 mRNA 水平。10.免疫组化检测各组瘤组织中E-cadherin、vimentin和N-cadherin的蛋白表达。第三部分miR-145调控骨肉瘤细胞系MG63 EMT发生的机制研究1.利用双荧光素酶报告基因验证NEDD9是否为miR-145的靶基因。将NEDD93’-UTR 的野生型(NEDD9-3’UTR-Wt)和突变型(NEDD9-3’UTR-Mut)序列插入pmirGLO载体,构建荧光素酶报告基因重组质粒pmirGLO-NEDD9-3’-UTR-Wt/Mut,然后分别与 miR-145 mimics 或 miR-145 NC 共转染MG63细胞,检测各组细胞荧光素酶活性。2.转染 miR-145 mimics 或 miR-145 NC 至骨肉瘤细胞系 MG63,利用 Western blot检测NEDD9蛋白表达。3.转染NEDD9 siRNA至骨肉瘤细胞系MG63,以siRNAnegative和未转染细胞分别作为阴性对照和空白对照;利用荧光定量RT-PCR和Western blot检测各组细胞NEDD9、E-cadherin、Snaill、vimentin 和 N-cadherin mRNA 水平和蛋白表达;利用Boyden Chamber侵袭小室实验检测各组细胞的侵袭能力;利用划痕实验检测各组细胞的迁移能力。4.利用Rescue实验进一步明确miR-145是否通过NEDD9对骨肉瘤细胞MG63的发挥作用。转染miR-145 inhibitor的MG63细胞中转染NEDD9 siRNA或siRNA negative,利用荧光定量RT-PCR和Western blot检测各组细胞E-cadherin、Snaill、vimentin 和 N-cadherin mRNA 水平和蛋白表达。结果第一部分miR-145在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系中的表达1.荧光定量RT-PCR结果显示,相对于癌症正常组织,miR-145在骨肉瘤组织中的表达显著降低(p<0.05)。2.miR-145的表达与病人肿瘤远处转移具有相关性,差异有统计学意义(p<0.05)。miR-145 mRNA在有远处转移的瘤组织中表达明显高于无转移组。3.荧光定量RT-PCR结果显示miR-145在3种骨肉瘤细胞系U20S、MG63和SAOS2中的表达均明显低于其在正常人成骨细胞系hFOB中的表达(p<0.05),且miR-145在侵袭转移能力高的骨肉瘤细胞系MG63中的表达又显著低于其在侵袭转移能力低的U20S和SAOS2中的表达。4.预测软件预测NEDD9为miR-145靶基因之一。5.骨肉瘤组织中NEDD9的表达明显高于其在癌旁正常组织中的表达,且在骨肉瘤组织中的表达与miR-145具有高度负相关性。第二部分miR-145对骨肉瘤细胞侵袭转移和EMT发生的影响1.荧光定量RT-PCR检测结果显示,骨肉瘤细胞系MG63转染miR-145 mimics后miR-145 mRNA水平与miR-145 NC组和脂质体处理组相比显著上调,差异具有统计学意义(p<0.05)。2.CCK8实验结果显示,与miR-145 NC组和脂质体处理组相比,转染miR-145 mimics组细胞增殖率在48h后出现明显的抑制(p<0.05)。3.转染miR-145 mimics组与miR-145 NC组和脂质体处理组相比,穿膜细胞数数显著降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。4.划痕实验结果显示,miR-145 mimics转染组细胞划痕修复能力最弱,与miR-145 NC组和脂质体处理组相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。5.miR-145 mimics转染组细胞中E-cadherin mRNA水平显著增高,而Snaill、vimentin和N-cadherin mRNA水平显著下降,与阴性对照组和空白对照相比差异有统计学意义(p<0.05)。6.Western blot结果显示,与对照组比较,miR-145 mimics转染组E-cadherin蛋白表达明显升高,而、vimentin和N-cadherin蛋白表达降低。7.裸鼠成瘤实验结果显示,miR-145 mimics转染组细胞接种的裸鼠肿瘤体积显著低于miR-145 NC组和脂质体处理组相比,差异有统计学意义(p<0.05),并且肿瘤生长速度远远低于对照组。8.利用荧光定量RT-PCR检测显示,与对照组比较,miR-145 mimics转染组细胞接种的裸鼠肿瘤组织中E-cadherin mRNA水平增高(2.12±0.3),而Snaill(0.63±0.02)、vimentin(0.57±0.02)和 N-cadherin mRNA(0.61 ±0.03)的mRNA水平均下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。9.免疫组化结果显示,与对照组相比,miR-145 mimics转染组细胞接种的裸鼠肿瘤组织中E-cadherin蛋白表达升高,而vimentin和N-cadherin蛋白的表达均降低。第三部分miR-145调控骨肉瘤MG63细胞EMT发生的机制研究1.miR-145 mimics 和重组载体pmirGLO-NEDD9-3’-UTR-Wt 共转染的 HEK293T细胞荧光素酶基因活性与对照组相比(miR-145NC)显著降低(p<0.05);而共转染 miR-145 mimics 和 pmirGLO-NEDD9-3’-UTR-Mut 的细胞萤光素酶基因活性与对照组相比(miR-145NC)无显著差异。2.转染NEDD9 siRNA后,骨肉瘤细胞系MG63中NEDD9的表达明显下降(p<0.05),说明所设计的NEDD9 siRNA能有效抑制NEDD9的表达。同时E-cadherin mRNA及蛋白水平较对照组显著升高(p<0.05),而Snaill、vimentin和N-cadherin mRNA及蛋白水平显著降低(p<0.05)。侵袭小室实验和划痕实验结果分别显示,NEDD9 siRNA转染组细胞侵袭能力和迁移能力也明显降低(p<0.05)。3.转染miR-145 mimics的骨肉瘤细胞系MG63中NEDD9的蛋白显著降低,与转染miR-145 NC的细胞相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。4.Rescue实验结果显示在转染miR-145 inhibitor的MG63细胞再转染NEDD9.siRNA 可以部分挽救 miR-145 下降所导致的 EMT。miR-145 inhibitor+NEDD9 siRNA转染组E-cadherin mRNA及蛋白水平较miR-145 inhibitor转染组显著升高,而Snaill、vimentin和N-cadherin mRNA及蛋白水平显著降低(p<0.05)。结论1.miR-145在骨肉瘤组织中呈低表达。且miR-145在瘤组织中的表达水平与骨肉瘤的远处转移相关。2.miR-145在人骨肉瘤细胞系U20S、MG63和SAOS2中低表达显著,且miR-145在骨肉瘤细胞系中的表达高低与骨肉瘤细胞的侵袭能力强弱相关。3.骨肉瘤组织中NEDD9的表达显著上调,与miR-145水平具有高度负相关性。4.miR-145可抑制骨肉瘤细胞系发生EMT,从而抑制细胞的侵袭和转移能力。5.NEDD9是miR-145的靶基因,miR-145可通过与NEDD9 3’-UTR区结合调控其表达抑制骨肉瘤细胞EMT的发生,调控骨肉瘤细胞的侵袭转移。