论文部分内容阅读
目的：本研究旨在探讨补肾法预防糖皮质激素性骨质疏松症(GIOP)的研究机制。通过回顾性临床病例研究,分析GIOP的中医证型总体分布特点,探究肾虚型GIOP的分布规律及其与相关发病因素的内在关联,为中医药从“肾”论治GIOP的科学内涵提供依据。通过动物实验,测定GIOP大鼠血清骨代谢指标、骨密度、骨生物力学性能及骨组织中LRP5、RUNX2、RANKL、NF-κB、β-catenin mRNA的表达,阐明补肾法预防大鼠GIOP的作用机制及效果,为中西结合预防GIOP提供依据。方法：1、临床研究：收集自2014年1月至2014年12月就诊于广州中医药大学第一附属医院脊柱骨的118例GIOP患者的病例资料,包括性别、年龄、体重指数(BMI),骨密度等,分析GIOP患者的中医证型分布特点及其与相关发病因素之间的内在关联。采用SPSS17.0软件包进行统计分析,测量数据以均数土标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,分类资料的比较采用卡方检验。2、动物实验研究：将45只大鼠随机分为5组：空白组9只,模型组9只、西药组9只、中药组9只、中西药联合组9只,成功建立糖皮质激素性大鼠骨质疏松模型后,空白组给予蒸馏水灌胃5 ml/kg/d;模型组予皮下注射泼尼松,给药剂量为5mg/kg/d;西药组在皮下注射泼尼松(5mg/kg/d)的基础上,予阿仑膦酸钠灌胃,给药剂量为lmg/kg/7d;中药组在皮下注射泼尼松(5mg/kg/d)的基础上,应用的补肾方按照人与大鼠体表面积折算,予每天灌胃给药浓度为0.25 g/mL,给药剂量为2.5 g/kg/d;中西药联合组予皮下注射泼尼松5 mg/kg/d、补肾方2.5 g/kg/d联合阿仑膦酸钠lmg/kg/7d。干预措施连用12周后麻醉处死大鼠。2.1大鼠血清骨代谢指标测定：采用ELISA法检测GIOP大鼠血清中骨形成标记物Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PINP)、骨吸收标记物Ⅰ型胶原羟基端肽(β-CTx)的表达。2.2大鼠骨密度检测：大鼠处死后,迅速完整分离GIOP大鼠腰1-3椎体,采用双能X线吸收骨密度检测仪(美国hologic公司)检测腰1-3整体的骨密度(BMD)、骨矿含量(BMC)。2.3大鼠骨组织Micro-CT检测：采用u CT80型Micro-CT机扫描GIOP大鼠腰4椎骨,获得大鼠腰4椎体骨微结构参数：骨体积分数(BV/TV,%),骨小梁厚度(Tb.Th,mm)、骨小梁数量(Tb. N,1/mm),骨小梁分离度(Tb.Sp, mm),结构模型指数(SMI)。2.4大鼠骨组织生物力学参数检测：GIOP大鼠腰4椎骨完成Micro-CT机扫描后,采用万能材料试验机(Electropuls E1000 test system,Instron Corporation,USA)对大鼠腰4椎骨进行压缩试验,测定大鼠椎骨的压缩刚度(N/mm),压缩强度(N)等相关力学参数。2.5 大鼠骨组织中LRP5、RUNX2、RANKL、NF-κB、β-catenin mRNA的表达：取GIOP大鼠腰6椎体、左胫骨组织进行qPCR实验。参照TAKARA公司提取试剂盒、逆转录试剂盒和荧光定量试剂盒进行操作,检测大鼠骨组织中LRP5、RUNX2、RANKL、NF-κB、β-catenin mRNA的表达。成果：1、本研究发现GIOP的中医证型可分为：肾阳虚、肾阴虚、肾阴阳两虚、气滞血瘀、脾胃虚弱等五种证型,其中肾阳虚型占27.12%,肾阴虚型占28.81%,肾阴阳两虚型占10.17%,脾胃虚弱型占14.41%、气滞血瘀型占19.49%,据此可知,GIOP患者的中医证型主要以肾虚为主,随着年龄的增长,肾虚的症候表现日趋明显,且肾虚型患者骨折发生率达80.64%,高于其它两组证型。2、动物实验研究结果如下：2.1 大鼠血清骨代谢指标：与模型组相比较,空白组、西药组、中药组及中西药联合组的血清β-CTX与PINP的表达差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.2 大鼠骨密度：与模型组相比较,空白组、西药组、中药组、中西药联合组大鼠BMD、BMC的差异均有统计学意义(P<0.05),与空白组相比较,西药组、中药组、中西药联合组的BMD、BMC的差异均无统计学意义(P>0.05)。2.3 大鼠骨组织Micro-CT:与模型组相比较,空白组、西药组、中药组及中西药联合组的骨分离度、结构模型指数的差异均具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比较,空白组、中西药联合组的骨小梁数的差异均具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比较,空白组、中药组的骨小梁厚度的差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.4 大鼠骨组织生物力学参数：与模型组相比较,空白组、西药组、中药组及中西药联合组的压缩强度(N)的差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比较,西药组、中西药联合组的压缩刚度(N/mm)的差异均有统计学意义(P<0.05)。2.5 大鼠骨组织中LRP5、RUNX2、RANKL、NF-KB、β-catenin mRNA的表达：与模型组相比,空白组、西药组、中药组及中西药联合组的LRP5、RUNX2、RANKLmRNA的表达差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较,空白组、西药组、中药组及中西药联合组中NF-KB、β-catenin mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1、本研究发现GIOP的中医证型可分为：肾阳虚、肾阴虚证、肾阴阳两虚、气滞血瘀、脾胃虚弱等五种证型,主要以肾虚型为主,且随着年龄的增长,肾虚的症候表现日趋明显。肾虚型患者发生骨折的比例达80.64%,高于其它两组证型的发生率,故临床诊疗中应着眼于从“肾”论治,以中医补肾为纲,中西并用预防GIOP及其并发症的发生。2、依据本研究动物实验结果,可得出如下结论：2.1 补肾方可通过上调GIOP大鼠血清成骨标记物PINP的表达含量、降低破骨标记物β-CTX的表达含量,达到促进成骨、抑制破骨而预防大鼠GIOP的效果。2.2补肾方干预后能显著提高GIOP大鼠的骨密度；在预防大鼠GIOP上具有确切疗效；此外,补肾方联合阿仑膦酸钠运用在提高GIOP大鼠的骨密度上优于单纯运用阿仑膦酸钠或补肾方。2.3补肾方可通过增加GIOP大鼠腰椎骨小梁数,降低骨分离度、结构模型指数,达到提升骨质量,改善骨强度,从而预防GIOP的发生。2.4补肾方能明显提升大鼠骨质的压缩刚度(N/mm)及压缩强度(N),通过改善GIOP大鼠腰椎骨的生物力学性能,达到预防大鼠GIOP的作用。2.5补肾方能够提高GIOP大鼠中反映成骨活性的LRP5、RUNX2mRNA、抑制反映破骨活性RANKLmRNA的表达,起到预防大鼠GIOP的作用。