背景:动脉粥样硬化性心脑血管疾病在2型糖尿病患者中的发生率和死亡率均明显增高,2型糖尿病患者是发生心脑血管疾病的高危人群。2型糖尿病发生动脉粥样硬化的易患因素包括高血糖、脂代谢紊乱、高血压等,但是往往在良好的血糖、血脂、血压控制的情况下仍然发生大血管病变。2型糖尿病患者体内存在氧化与抗氧化系统的失衡,增强的氧化应激从内皮细胞功能紊乱、血管炎症、动脉粥样硬化斑块形成和易脆性、前血栓状态的促进等多个病理生理学方面加速大血管病变的进展。晚期氧化蛋白产物(AOPP)是Witko-sarsat于1996年首次从尿毒症患者血浆中发现的一种尿毒症毒素,主要是血清白蛋白的酪氨酸残基被活化的中性粒细胞髓过氧化物酶产生的次氯酸氧化形成的蛋白交联产物。AOPP是敏感而精确的氧化应激标志物,又可加重氧化应激,是潜在的氧化应激诱导物,同时促进炎症的发展,起到炎症介质的作用。很多实验表明AOPP与动脉粥样硬化密切相关,但是,AOPP促进动脉粥样硬化的具体机制还不明确。基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)是一种高效的淋巴细胞、单核细胞趋化因子,表达于血管内皮细胞、平滑肌细胞等。研究表明在动脉粥样硬化斑块中的平滑肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞中均有SDF-1α高表达,并且SDF-1α可趋化单核细胞进入血管壁,说明SDF-1α参与了动脉粥样硬化的形成。丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)通路是细胞内主要的信号转导通路,多种外界刺激作用于细胞后通过这一通路将信号传递到细胞核,介导细胞产生各种反应。哺乳动物细胞MAPK通路主要有:ERK, JNK/SAPK, p38三条途径。本研究拟探讨AOPP对人血管内皮细胞与单核细胞粘附的影响,对SDF-1α趋化单核细胞的作用,以及对人血管内皮细胞SDF-1αmRNA表达及蛋白合成的影响,同时探讨这一作用是否通过MAPK径路转导,最后从临床角度观察2型糖尿病患者血浆AOPP水平及其与心血管危险因素的关系。方法:一、ECV304细胞株及THP-1细胞株的培养两种细胞均常规培养于37℃,5%CO2湿润的恒温孵箱中。培养液为含有10%胎牛血清的RPMI1640。取第3-5代用于实验,以台盼蓝染色法检测细胞死亡率,各组细胞死亡率均≤5%。二、AOPP-BSA的制备200mg/ml BSA与0.2mol/L NaOCl各取等量混合(即以1:60摩尔比混合),室温孵育30分钟,4℃以0.01mol/L PBS(pH 7.4)透析24小时,0.22μm硝酸纤维素膜过滤消毒,-70℃冻存。以经同样处理但未加NaOCl的BSA作对照。酸性条件340nm测AOPP-BSA浓度,以氯胺-T为标准品,实际测定的为AOPP对氯胺-T的相对浓度。三、THP-1/ECV304细胞粘附实验将ECV304细胞接种于6孔板,加入不同浓度AOPP,之后再加入THP-1细胞37℃孵育30分钟,倒置显微镜下计数每个视野粘附的THP-1细胞数。四、SDF-1α趋化THP-1细胞实验单核细胞迁移用8μM孔径的Transwell小室来分析。不同浓度AOPP预处理24小时的THP-1细胞加到上室,下室加入不同浓度的SDF-1α,37℃孵育10小时后取出上室,在300×显微镜下连续计数4个视野的细胞数,取其平均值。五、SDF-1αmRNA的测定ECV304细胞分别与细胞培养基、200μmol/l BSA、50、100、200μmol/l AOPP-BSA共同孵育6小时,或者与200μmol/l AOPP-BSA共同孵育0、2、6、12、24小时后,收集细胞,加入Trizol试剂提取细胞总RNA。RT-PCR法测定SDF-1αmRNA的表达。六、SDF-1α蛋白的测定ECV304细胞分别与细胞培养基、200μmol/l BSA、50、100、200μmol/l AOPP-BSA共同孵育12小时,或者与200μmol/l AOPP-BSA共同孵育0、2、6、12、24小时后,收集细胞,提取细胞总蛋白。Western-blot法测定SDF-1α蛋白的表达。阻断实验中先以不同浓度的p38MAPK特异性阻断剂SB203580或者ERK1/2特异性阻断剂U0126与ECV304孵育1小时,然后与200μmol/l AOPP-BSA共同孵育12小时,ELISA法测定上清液中SDF-1α蛋白浓度。七、p-p38MAPK及p-ERK1/2蛋白的测定ECV304细胞分别与细胞培养基、200μmol/l BSA、50、100、200μmol/l AOPP-BSA共同孵育15分钟,或者与200μmol/l AOPP-BSA共同孵育0、15、30、60、120分钟后,收集细胞,提取细胞总蛋白。Western-blot法测定p-p38MAPK及p-ERK1/2蛋白的表达。八、2型糖尿病患者血清SDF-1α及AOPP浓度测定清晨空腹抽取静脉血5ml加入含10% EDTA的抗凝管中,离心取上清。SDF-1α浓度采用酶联免疫吸附法,按照说明书进行,用荧光免疫分析仪检测每孔在450nm处的吸光度。AOPP浓度应用分光光度法测定,血清与PBS按1∶5稀释,以氯胺-T同法稀释作空白对照,加入1.16 mmol/L KI 10μl及乙酸20μl后立刻测340 nm处的吸收度值。结果:一、AOPP呈剂量依赖性的方式促进THP-1细胞与ECV304细胞的粘附未经AOPP处理时粘附于ECV304的THP-1细胞甚少,50μmol/l的AOPP就可使粘附的THP-1细胞数目明显增加,以200μmol/l的AOPP组所粘附的细胞数目最多,与对照组相比较增加了约26倍。二、AOPP呈剂量依赖性的方式增强SDF-1α对THP-1细胞的趋化作用将不同浓度AOPP处理24小时后的THP-1细胞用10ng/ml SDF-1α进行趋化。随着AOPP浓度的增加,被趋化的细胞数也逐渐增加,200μmol/l AOPP组所趋化的细胞数是对照组的11倍。三、AOPP呈时间和剂量依赖的方式促进ECV304细胞SDF-1αmRNA表达增加与200μmol/L AOPP-BSA孵育2小时后ECV304细胞SDF-1αmRNA表达量较对照组既显著增加,6小时达高峰,之后逐渐下降,24小时SDF-1αmRNA表达量与对照组比较无显著差异。与50μmol/l,100μmol/l,200μmol/L AOPP-BSA孵育6小时后ECV304细胞SDF-1αmRNA表达量依次升高,与对照组相比差异有统计学意义。200μmol/L BSA孵育或者未加处理因素者也有SDF-1αmRNA的表达,两组间无差异。四、AOPP呈时间和剂量依赖的方式促进ECV304细胞SDF-1α蛋白合成增多与200μmol/L AOPP-BSA孵育2小时后SDF-1α蛋白合成量较对照组显著增加,随时间的推移蛋白合成量逐渐增加,24小时合成量最多。与50μmol/l,100μmol/l,200μmol/L AOPP-BSA孵育24小时后ECV304细胞SDF-1α蛋白合成量依次增加,与对照组相比差异有统计学意义。与200μmol/L BSA孵育或者未加处理因素者也有SDF-1α蛋白的合成,两组间无差异。五、AOPP呈时间和剂量依赖的方式促进ECV304细胞p-p38MAPK及p-ERK1/2蛋白合成增多与200μmol/L AOPP-BSA孵育15分钟后p-p38MAPK及p-ERK1/2蛋白合成量较对照组显著增加,之后逐渐下降,120分钟仍处于较高水平。与50μmol/l,100μmol/l,200μmol/L AOPP-BSA孵育15分钟后ECV304细胞p-p38MAPK及p-ERK1/2蛋白合成量依次增加,与对照组相比差异有统计学意义。六、p38MAPK特异性阻断剂SB203580或者ERK1/2特异性阻断剂U0126均可呈剂量依赖方式阻断AOPP对ECV304细胞SDF-1α蛋白合成的促进作用0.1μM的SB203580或者U0126均可明显抑制AOPP-BSA对SDF-1α蛋白合成的促进作用,随着阻断剂浓度的增加,抑制率逐渐升高,10μM阻断剂的抑制率最高。七、2型糖尿病患者血清AOPP及SDF-1α水平升高,血清AOPP水平与多种心血管危险因素相关与正常对照组相比,2型糖尿病患者血清AOPP及SDF-1α水平显著升高。2型糖尿病患者中血糖控制良好组血清AOPP水平高于血糖控制不良组,胰岛素抵抗(IR)组血清AOPP水平高于非胰岛素抵抗(non-IR)组,有大血管并发症组血清AOPP水平明显高于无大血管并发症组。2型糖尿病患者中高AOPP组体重指数(BMI),空腹血糖(FPG),糖化血红蛋白(GHbA1c),甘油三酯(TG)及SDF-1α水平明显高于正常AOPP组,差异均有统计学意义。单因素相关分析显示2型糖尿病患者血清AOPP水平与FPG, GHbA1c,TG,BMI,HOMA-IR及SDF-1α呈正相关。logistic回归分析显示,影响2型糖尿病大血管并发症的因素有年龄、血清AOPP水平和平均血压(MBP)。结论:一、AOPP呈剂量依赖方式促进ECV304细胞与THP-1细胞间的粘附,同时增强SDF-1α对THP-1细胞的趋化作用。二、AOPP呈时间和剂量依赖的方式促进ECV304细胞SDF-1αmRNA表达及蛋白合成增加。三、AOPP促进ECV304细胞SDF-1α蛋白合成增加是通过p38MAPK及ERK1/2信号转导通路。四、2型糖尿病患者血清AOPP及SDF-1α水平升高,血清AOPP水平与多种心血管危险因素相关,是2型糖尿病患者大血管并发症发生的独立危险因素。