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商业化芽孢杆菌益生菌制剂常以孢子的形式为主。本论文通过比较收集的不同商用芽孢杆菌菌株的生物学特性，得到一株性状优良的菌株，以该菌株为例，构建了快速准确且灵敏度高的芽孢杆菌芽孢体的特异性检测方法，并将该方法应用于芽孢杆菌液态发酵和固态发酵的优化设计，从而为益生芽孢杆菌的发酵生产提供一种通用的快速评价和生产制备方法。研究内容及相关结果如下：
（1）收集整理了15种市场上药用和饲用的益生芽孢杆菌相关产品，对其使用的芽孢杆菌进行分离鉴定，分别从产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶等酶活测试、抗菌活性、耐酸和耐胆盐稳定性、抗生素敏感性以及耗氧及生长速率测试等方面对15株芽孢杆菌的菌株特性进行了比较研究。（2）在实验室前期研究基础上，即根据芽孢在高温高压下释放出的2，6-吡啶二羧酸（DPA）与 Eu2+和螯合剂CyDTA形成的荧光复合物的荧光特性来实现芽孢的快速定量测定，以分离出的出发菌株为对象，建立菌株芽孢浓度（CFU/mL）及相应荧光强度之间的线性关系。（3）基于 DPA荧光强度检测芽孢浓度方法，本试验进一步探讨该方法在优化芽孢菌株液态发酵孢子产量的可行性。以样品中孢子DPA荧光强度为响应值，分别通过单因子试验和中心组合试验优化无机金属离子和工业原料的选择及其组合浓度。在此基础上，探究了络合物CTS-Zn对发酵液中菌体絮凝回收的效果。（4）基于DPA荧光强度检测芽孢浓度方法，实现菌株纯种固态发酵培养基及培养条件的优化。在优化的培养基及培养条件基础上，对发酵进程及代谢活性进行了研究。（5）此外，本试验进一步探讨不灭菌的发酵基质中出发菌株参与的复合固态发酵条件。
结果显示，（1）与其它菌株相比，S9的菌株表现出较高的综合酶活及抗菌能力。S9、Y2和S8的营养体细胞具有较高的耐酸能力，S9、Y2的菌株在0.3%的胆盐环境中存活率超过90%；并且S9具有较快的耗氧速率和生长速率。通过16s rDNA分子鉴定，菌株 S9初步鉴定并命名为解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amylolyquefaciens BS-20。（2）构建的关系曲线表明，芽孢浓度在104-107 CFU/mL时与其相应的荧光复合物荧光强度具有良好线性（R2>0.999），芽孢浓度的检测限达到8×103 CFU/mL；对不同取样时间的发酵液分别采用DPA荧光计数法与常规平板计数方法进行检测，测定结果无显著差异。（3）在液态发酵优化中，当培养基成分为：葡萄糖8.0 g/L、牛肉浸粉7.5 g/L、Mn2+1.0 mM、Fe2+3.0 mM、Ca2+2.1 mM、Mg2+3.0 mM、9.0 g/L玉米粉及9.5 g/L豆粕粉时，培养基中孢子浓度提高了8.8倍。确定了接种量5％、初始pH7.0、摇床转速200 rpm为最适培养条件。采用传统的平板计数方法，对 DPA荧光计数法检测孢子浓度进行了统一验证，两种方法测定结果无显著差异。最终优化后的孢子产量达到8.35×109 CFU/mL。在发酵液pH值为4.5、CTS-Zn=3:1及其终浓度为0.5 g/L时，絮凝效果最佳，最终回收后菌体的存活率达到93％，浓缩率为90％。（4）在纯种固态发酵中，确定了固体基质最佳配比为玉米粉：豆粕粉：麦麸=1:1:3，当葡萄糖为8 g/L、蛋白胨为2 g/L、Mn2+1.0 mM时，固体基质中的孢子浓度达到6.6×1010 CFU/g。确定了接种量6％、初始pH7.0、含水量50％、基质装量30 g/250 mL、培养时间48 h为最适培养条件，此时孢子浓度为7.1×1010 CFU/g。采用传统的平板计数方法，对 DPA荧光计数法检测孢子浓度进行了统一验证，两种方法测定结果无显著差异。在48h时，代谢活性物质的产量达到最大，分别为：蛋白酶573.0 U/g、淀粉酶188.8 U/g、纤维素酶186.8 U/g、酸溶蛋白3.45 mg/g。（5）为防止发酵基质在培养过程中的污染，通过引进乳杆菌Lactobacillus reuteri C5和酵母菌Saccharomyces boulardii SC18分别作为单一或者复合发酵剂，比较不同发酵时间点时的pH以及代谢产生的活性物质产量，结果表明，菌株L. reuteri C5+S. boulardii SC18+B. amylolyquefaciens BS-20组合作为复合发酵剂处理的固体发酵基质的pH及还原糖下降最快、酸溶蛋白含量最高，达到4.20 mg/g，各菌株的活菌数相较其它实验组显著提高，发酵过程无明显污染。
综上所述，本实验通过比较不同种类商业用益生芽孢杆菌菌株的生物学特性，探讨了一种益生芽孢杆菌筛选的方法；建立了一种快速定量检测芽孢杆菌芽孢体的方法，并成功将该方法应用于芽孢杆菌液态和固态发酵的快速优化设计中。本论文尝试建立起一套益生芽孢杆菌菌株选育、发酵优化、生产制备等较为完整的研究和应用体系，从而为益生芽孢杆菌制剂的研发和工业化生产提供方法学基础。
（1）收集整理了15种市场上药用和饲用的益生芽孢杆菌相关产品，对其使用的芽孢杆菌进行分离鉴定，分别从产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶等酶活测试、抗菌活性、耐酸和耐胆盐稳定性、抗生素敏感性以及耗氧及生长速率测试等方面对15株芽孢杆菌的菌株特性进行了比较研究。（2）在实验室前期研究基础上，即根据芽孢在高温高压下释放出的2，6-吡啶二羧酸（DPA）与 Eu2+和螯合剂CyDTA形成的荧光复合物的荧光特性来实现芽孢的快速定量测定，以分离出的出发菌株为对象，建立菌株芽孢浓度（CFU/mL）及相应荧光强度之间的线性关系。（3）基于 DPA荧光强度检测芽孢浓度方法，本试验进一步探讨该方法在优化芽孢菌株液态发酵孢子产量的可行性。以样品中孢子DPA荧光强度为响应值，分别通过单因子试验和中心组合试验优化无机金属离子和工业原料的选择及其组合浓度。在此基础上，探究了络合物CTS-Zn对发酵液中菌体絮凝回收的效果。（4）基于DPA荧光强度检测芽孢浓度方法，实现菌株纯种固态发酵培养基及培养条件的优化。在优化的培养基及培养条件基础上，对发酵进程及代谢活性进行了研究。（5）此外，本试验进一步探讨不灭菌的发酵基质中出发菌株参与的复合固态发酵条件。
结果显示，（1）与其它菌株相比，S9的菌株表现出较高的综合酶活及抗菌能力。S9、Y2和S8的营养体细胞具有较高的耐酸能力，S9、Y2的菌株在0.3%的胆盐环境中存活率超过90%；并且S9具有较快的耗氧速率和生长速率。通过16s rDNA分子鉴定，菌株 S9初步鉴定并命名为解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amylolyquefaciens BS-20。（2）构建的关系曲线表明，芽孢浓度在104-107 CFU/mL时与其相应的荧光复合物荧光强度具有良好线性（R2>0.999），芽孢浓度的检测限达到8×103 CFU/mL；对不同取样时间的发酵液分别采用DPA荧光计数法与常规平板计数方法进行检测，测定结果无显著差异。（3）在液态发酵优化中，当培养基成分为：葡萄糖8.0 g/L、牛肉浸粉7.5 g/L、Mn2+1.0 mM、Fe2+3.0 mM、Ca2+2.1 mM、Mg2+3.0 mM、9.0 g/L玉米粉及9.5 g/L豆粕粉时，培养基中孢子浓度提高了8.8倍。确定了接种量5％、初始pH7.0、摇床转速200 rpm为最适培养条件。采用传统的平板计数方法，对 DPA荧光计数法检测孢子浓度进行了统一验证，两种方法测定结果无显著差异。最终优化后的孢子产量达到8.35×109 CFU/mL。在发酵液pH值为4.5、CTS-Zn=3:1及其终浓度为0.5 g/L时，絮凝效果最佳，最终回收后菌体的存活率达到93％，浓缩率为90％。（4）在纯种固态发酵中，确定了固体基质最佳配比为玉米粉：豆粕粉：麦麸=1:1:3，当葡萄糖为8 g/L、蛋白胨为2 g/L、Mn2+1.0 mM时，固体基质中的孢子浓度达到6.6×1010 CFU/g。确定了接种量6％、初始pH7.0、含水量50％、基质装量30 g/250 mL、培养时间48 h为最适培养条件，此时孢子浓度为7.1×1010 CFU/g。采用传统的平板计数方法，对 DPA荧光计数法检测孢子浓度进行了统一验证，两种方法测定结果无显著差异。在48h时，代谢活性物质的产量达到最大，分别为：蛋白酶573.0 U/g、淀粉酶188.8 U/g、纤维素酶186.8 U/g、酸溶蛋白3.45 mg/g。（5）为防止发酵基质在培养过程中的污染，通过引进乳杆菌Lactobacillus reuteri C5和酵母菌Saccharomyces boulardii SC18分别作为单一或者复合发酵剂，比较不同发酵时间点时的pH以及代谢产生的活性物质产量，结果表明，菌株L. reuteri C5+S. boulardii SC18+B. amylolyquefaciens BS-20组合作为复合发酵剂处理的固体发酵基质的pH及还原糖下降最快、酸溶蛋白含量最高，达到4.20 mg/g，各菌株的活菌数相较其它实验组显著提高，发酵过程无明显污染。
综上所述，本实验通过比较不同种类商业用益生芽孢杆菌菌株的生物学特性，探讨了一种益生芽孢杆菌筛选的方法；建立了一种快速定量检测芽孢杆菌芽孢体的方法，并成功将该方法应用于芽孢杆菌液态和固态发酵的快速优化设计中。本论文尝试建立起一套益生芽孢杆菌菌株选育、发酵优化、生产制备等较为完整的研究和应用体系，从而为益生芽孢杆菌制剂的研发和工业化生产提供方法学基础。