为了进一步研究其可能的生物学作用和作用机制，分别用体内试验(采用ApoE-/-小鼠模型)和体外试验(采 用巨噬泡沫细胞模型)，研究其可能的分子机制并进一步明确丹参酮Ⅱ A抗As可能的作用靶点。 研究方法： 一．丹参酮ⅡA对动脉粥样硬化的影响 1.动物的分组和处理 采用经典的ApoE-/-。小鼠模型，将其随机分为七组，分别为正常组(C57BL/6J)，模型组(ApoE-/-)，模型+丹参酮ⅡA高剂量组(ApoE-/-+TS(90mg/kg))，模型+丹参酮Ⅱ A中剂量组(ApoE-/-+TS(30 mg/kg))，模型+丹参酮Ⅱ A低剂量组(ApoE-/-+TS(10 mg/kg))，模型+辛伐他丁(ApoE-/-+Sim(10mg/kg))，模型+维生素E(ApoE-/-+VE(100 mg/kg))，药物用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作溶剂，所有组别皆给予正常饲料。动态检测血脂水平并动态观察动脉粥样硬化斑块形成程度，直至26周。 2.丹参酮Ⅱ A对动脉粥样硬化形成的影响 ①丹参酮Ⅱ A对动脉粥样硬化斑块面积的影响 将小鼠的主动脉分离取出，然后取其主动脉弓，纵向剖开作油红O染色，做成病理切片后用荧光显微镜(sony-DXC960MD)观察拍照，运用IPWIN60进行分析。 ②丹参酮ⅡA对血清中血脂水平和肝脏中血脂水平的影响 血清中总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的检测使用常规的酶法试剂盒(北京中生北控)。肝脏中TC和TG的检测采用100mg/ml在蒸馏水中匀浆，后采用氯仿甲醇(2/1，v/v)萃取，提取的脂质用液氮吹干后用异丙醇重新溶解，通过试剂盒检测起血脂的浓度。 ③丹参酮ⅡA对血清中oxLDL的影响 采用ELISA法检测血清中的oxLDL的含量。严格按照试剂盒所附说明书进行操作。在包被好抗兔oxLDL，抗体的96孔板中加入50ul的标准，蒸馏水，和样本，然后加入生物素结合的反应液50ul，将其置于37℃孵育60min。孵育结束后，将反应液倒出，然后用在洗板机上用专用的洗涤液洗5次，将未结合的从孔内洗去，然后将50u1的酶结合反应液加入孔内将其置于37℃孵育30min，再一次在洗板机上用洗涤液洗5次，然后分别加入50ul的显色剂A和显色剂B置于37℃孵育15min，最后加入终止液终止反应，置于酶标仪上在450nm处检测吸光度值(OD)。同时依据一个剂量依赖的标准曲线可以最终得出样品血清中oxLDL的浓度。 ④丹参酮ⅡA对血清中SOD和MDA的影响 分别采用常规的试剂盒检测血清中SOD活性和MDA含量。各组血清的SOD活性和MDA含量检测的具体方法严格按照试剂盒所附说明书进行。在检测之前摸索一个最佳的反应体积，经摸索血清SOD的最佳上样量为2ul。 ⑤丹参酮Ⅱ A对胆固醇摄取相关基因(CD36,SR-A)表达的影响 提取小鼠胸腹主动脉中的RNA,采用半定量RT-PCR的方法检测胆固醇摄取相关基因表达的情况。 ⑥丹参酮Ⅱ A对PPAR-γ表达的影响 提取小鼠胸腹主动脉中的RNA,采用半定量的RT-PCR的方法检测PPAR-γ表达的情况。 二．丹参酮ⅡA对巨噬细胞摄取胆固醇的影响 1.巨噬细胞的培养与巨噬泡沫细胞模型的建立 2.丹参酮Ⅱ A对巨噬细胞胆固醇摄取的影响 3.丹参酮ⅡA对巨噬细胞胆固醇摄取相关基因以及对PPAR~表达的影响。 研究结果： 一．丹参酮ⅡA对动脉粥样硬化的影响 1.与正常对照组相比，26W后各组ApoE-/-小鼠在体重和一般特征上没有显著性差异 2.与正常对照组相比，26W后模型组ApoE-/-鼠斑块面积有明显的显著性差异，而与模型组ApoE-/-小鼠相比，丹参酮ⅡA对ApoE-/-小鼠斑块面积具有明显的改善作用，且随着剂量的增加具有明显的剂量依赖性，同时使用的两个阳性对照药亦具有很好的改善斑块形成的作用。 3.与正常对照组相比，26W后模型组ApoE-/-小鼠胸腹主动脉血脂水平明显升高，与正常对照组相比有显著性差异，而与模型组ApoE-/-小鼠相比，丹参酮ⅡA应用组ApoE-/-小鼠胸腹主动脉血脂具有明显的下降，且具有剂量依赖性。同时使用的两个阳性对照药亦具有很好的降低胸腹主动脉血脂的作用，且丹参酮Ⅱ A高剂量组的作用与其作用基本相似。 4.与正常对照组相比，26W后模型组ApoE-/-小鼠血清中TC和TG水平明显升高，但应用丹参酮Ⅱ A对血清中血脂没有影响，VE组亦没有影响，辛伐他丁组却能很好的显示其降血脂的作用 5.与正常对照组相比，26W后模型组．ApoE-/-小鼠肝脏中TC和TG水平明显升高，但应用丹参酮ⅡA组对肝脏中血脂没有影响，VE组亦没有影响，辛伐他丁组却能很好的显示其降血脂的作用 6.与正常对照组相比，26W后模型组ApoE-/-小鼠血清中oxlLDL含量明显升高，而与模型组ApoE-/-小鼠相比，丹参酮Ⅱ A应用组ApoE-/-小鼠血清oxLDL水平具有明显的下降，且具有明显的剂量依赖性，阳性对照药物辛伐他丁和VE组亦具有降低血清中oxLDL的作用 7.与正常对照组相比，26W后模型组ApoE-/-小鼠血清中SOD水平明显下降，而与模型组ApoE-/-小鼠相比，丹参酮IIA应用组ApoE-/-小鼠血清中SOD明显升高，且具有剂量依赖性，阳性对照药物辛伐他丁和VE组亦有升高血清中SOD的作用。与正常对照组相比，26W后模型组ApoE-/-小鼠血清中MDA水平明显升高，而与模型组ApoE-/-小鼠相比，丹参酮IIA应用组ApoE-/-小鼠血清中MDA水平明显下降，且具有剂量依赖性，同时阳性对照药物辛伐他丁和VE组亦有降低血清中MDA的作用． 8.与正常对照组相比，26W后模型组ApoE-/-小鼠胸腹主动脉胆固醇摄取相关基因CD36和SR-A具有显著的上调，而与模型组ApoE-/-小鼠相比，丹参酮ⅡA应用组对胆固醇摄取相关基因具有剂量依赖性的显著从下调作用，而阳性对照药物辛伐他丁和VE组虽亦有下调作用，但其作用相对丹参酮Ⅱ A而言比较的微弱。 二．丹参酮ⅡA对巨噬细胞胆固醇摄取的影响 1.丹参酮ⅡA抑制巨噬细胞对胆固醇的摄取 与正常对照组相比，将O．1 μ M，1 μ M，10 μ M丹参酮Ⅱ A分别与巨噬细胞预孵育24h,用MTT。法来评价丹参酮Ⅱ A对巨噬细胞的毒性，结果发现，0.1 μM．1 μ M．10 μ M丹参酮Ⅱ A作用细胞后，吸光度值没有明显变化，说明实验所用的丹参酮ⅡA浓度对巨噬细胞的毒性和增殖没有明显的影响。 与正常对照组相比，将0.1 μ M，1 μ M，10 μ M丹参酮ⅡA分别与巨噬细胞预孵育2h，再与50 μ g/ml的oxLDL作用24h，酶法检测细胞总胆固醇和游离胆固醇的含量，对细胞总胆固醇和游离胆固醇的含量检测发现，丹参酮Ⅱ A能够很好的抑制巨噬细胞对胆固醇的摄取，且具有剂量依赖性，其最大的抑制率可以达到40％左右。 与正常对照组相比，将0.1 μ M，1 μ M，10 μ M丹参酮Ⅱ A分别与巨噬细胞预孵育2h，再与DiI标记的oxLDL作用4h,荧光显微镜下定性观察丹参酮Ⅱ A对巨噬细胞胆固醇摄取的影响，结果发现，丹参酮Ⅱ A能够很好的抑制巨噬细胞对胆固醇的摄取，且具有剂量依赖性。 2.丹参酮Ⅱ A对巨噬细胞胆固醇摄取相关基因以及基因PPAR-γ表达的影响 与正常对照组相比，模型组(oxLDL)胆固醇摄取相关基因CD36和SR-A以及PPAR-γ显著上调，而丹参酮Ⅱ A组能够显著下调CD36和PPAR-γ的表达，但对SR-A的表达却无明显的影响。免疫荧光结果发现，丹参酮ⅡA组能够在蛋白水平上显著的下调CD36的表达。 小结： 1.丹参酮Ⅱ A能够显著改善动脉粥样硬化的形成与发展，这一作用具有明显的剂量．效应关系 2.丹参酮Ⅱ A改善动脉粥样硬化的形成不是通过影响血脂的水平，可能是通过以下机制共同作用实现：通过抗氧化作用降低血清中oxLDL的水平，改善血清中SOD和MDA的水平；抑制主动脉中胆固醇摄取相关基因CD36和SR-A而抑制泡沫细胞的形成，而对CD36的下调可能是通过下调PPAR-γ实现。 3.丹参酮IIA能够抑制巨噬细胞对胆固醇的摄取从而抑制泡沫细胞的形成。