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研究背景：
临床上因恶性肿瘤切除、外伤、气道梗阻等原因需要进行气管重建。气管移植是解决此类长段气管缺损的重要手段。近年来，同种异体气管移植研究取得了较大进展，但气管移植后发生气道梗阻的问题没有彻底解决，这依然是导致移植失败的主要原因。气管移植后狭窄的原因除软骨软化塌陷外，还与气管腔内的异常增生有关。其病理学基础是慢性的纤维组织增生，该过程包括纤维化效应细胞的增殖、分化和细胞外基质的过度沉积。研究显示，纤维化效应细胞来源包括骨髓的间充质干细胞、发生上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)的上皮细胞以及纤维化部位的成纤维细胞。在小鼠原位气管移植术后，宿主上皮细胞在增生、覆盖移植段气管的同时，发生了明显的EMT，提示上皮细胞的EMT在气管移植后气道重构中可能发挥重要作用。值得注意的是，Duan等发现丹参酮IIA可以通过抑制EMT，缓解气管移植后的纤维化狭窄，以上证据提示，调控气管移植后的EMT进展可能是缓解气管纤维化狭窄的有效手段。
褪黑素是一种吲哚类激素，负责调节睡眠和生物节律。新近研究发现褪黑素有多重生物学作用，如抗缺血、抗炎、调节代谢、抑制纤维化等。在纤维化研究领域，褪黑素已被证实参与调控心脏、肝脏、肾脏、肺组织等多种器官的纤维化过程。肺组织相关研究显示，褪黑素不但可以在离体水平抑制TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞EMT，还能从在体水平抑制肺泡上皮细胞EMT缓解博来霉素诱导的肺纤维化。然而褪黑素能否通过抑制气管上皮细胞的EMT来缓解气管移植术后的纤维化狭窄尚无研究报道。
沉默信息调控因子3(Silent information regulator 3，SIRT3)是NAD+依赖的脱乙酰化酶家族的一员，是线粒体内主要的乙酰化调节分子。SIRT3通过调控底物乙酰化，在线粒体抗氧化应激、解毒、调节三羧酸循环等过程中发挥重要作用。新近研究显示，SIRT3在心脏、肺脏、肝脏、肾脏等多个脏器的多种纤维化模型中有明确的调控作用。多项研究证实SIRT3是褪黑素的靶分子，SIRT3参与介导了褪黑素的抗缺血、抗纤维化等生物学作用。糖原合成酶激酶3β(Glycogensynthasekinase3，GSK3β)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，进化保守，参与调控细胞增殖、分化、纤维化、应激、凋亡等信号转导过程。值得注意的是，SIRT3可以脱乙酰化激活GSK3β，进而诱导Smad3降解，最终抑制肺组织EMT和纤维化进程。那么SIRT3/GSK3β信号通路是否参与了气管移植后的EMT过程尚不清楚。
AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶家族的一员，在各种器官和组织中都有表达。越来越多的证据表明，AMPK在纤维化过程中有明确的保护作用，可以参与调控包括心脏、肝脏、肺脏、肾脏、和皮肤在内的多个脏器或组织的纤维化。值得注意的是，褪黑素可以直接或间接激活AMPK，发挥抗心肌缺血再灌注损伤、调节脂代谢、维持卵巢功能、抑制肾纤维化等多重生物学作用。基于此，我们推测AMPK可能参与气管移植后的EMT过程。
综上，我们提出假设：褪黑素可能通过调控AMPK和(或)SIRT3-GSK3β进而抑制气管移植后的EMT，缓解气管移植后的纤维化狭窄。本项目将首先从离体和在体水平证实褪黑素的抗EMT作用；进而明确AMPK和(或)SIRT3-GSK3β在该过程中发挥的作用及具体机制。本研究希望进一步阐明气管移植后纤维化狭窄的分子机制，探索可能的抗纤维化靶点，为气管移植相关的基础和临床研究提供理论参考。
研究目的：
1明确褪黑素是否通过调控EMT发挥抗气管移植后狭窄的作用。
2明确褪黑素是否通过调控SIRT3-GSK3β发挥抗EMT作用。
3明确褪黑素是否通过调控AMPK发挥抗EMT作用。
研究方法：
1.褪黑素对原位气管移植后纤维化狭窄的影响
本部分实验拟首先从在体水平证实褪黑素抗气管移植后狭窄的作用；进而明确EMT是否参与了褪黑素抗气管移植后纤维化的过程；然后在细胞水平建立16HBE细胞的EMT模型，进一步验证褪黑素的抗EMT作用。
1.1建立大鼠气管原位移植模型，分别在术后第3天，1周，2周，5周取气管组织进行检测，初步明确移植后不同时间点气管的形态和组织学改变。
1.2将SD大鼠分为假手术组、气管移植组、气管移植+褪黑素处理组，于术后不同时间点处死大鼠，取气管组织进行HE染色、马松染色，计算LCR值和纤维化比值，明确褪黑素处理对气管移植后狭窄的影响。
1.3TGF-β1信号通路是调控EMT的核心通路。本部分拟从蛋白水平和mRNA水平检测褪黑素处理对移植后的气管组织中TGF-β1信号通路的影响。
1.4建立离体气管上皮细胞的EMT模型，进一步验证褪黑素的抗EMT作用。
2.SIRT3-GSK3β信号通路介导褪黑素抗EMT作用的机制研究
本部分拟首先通过RNA-seq筛选出褪黑素可能的调控靶点，然后通过调控其表达水平验证其介导了褪黑素的保护作用，进而阐明该分子介导褪黑素保护作用的具体机制，最后在大鼠气管移植模型中调控该分子表达或活性，观察其对褪黑素抗气管移植后狭窄的影响。
2.1转录组测序筛选褪黑素调控EMT的潜在靶点，并进行mRNA和蛋白水平验证。
2.2用Lenti-SIRT3OE慢病毒构建SIRT3稳定过表达的16HBE细胞株，用SIRT3siRNA下调SIRT3表达，分别这两种细胞建立EMT模型，给予褪黑素处理，检测EMT标志分子和TGF-β1信号通路分子，明确SIRT3介导了褪黑素的抗EMT作用。
2.3进一步探索SIRT3调控TGF-β1信号通路和EMT的内在机制，明确SIRT3通过激活GSK3β进而促进Smad3降解来抑制EMT。
2.4建立大鼠气管原位移植模型，在体应用SIRT3活性抑制剂，观察其对褪黑素抗气管移植后狭窄的影响。
3.AMPK介导褪黑素抗EMT作用的机制研究
本部分研究首先明确AMPK在褪黑素处理后的气管组织和气管上皮细胞中的激活情况，进而在细胞水平激活、抑制AMPK活性，观察其对褪黑素抗EMT作用的影响。最后在体应用AMPK抑制剂，观察其对褪黑素抗气管移植后纤维化狭窄的影响。
3.1检测气管移植后的气管组织中，以及发生EMT的16HBE细胞中AMPK的激活情况，证实AMPK可能参与了上述过程。
3.2抑制AMPK观察其对褪黑素抗EMT作用的影响，然后单独应用AMPK激动剂观察其对EMT过程的影响，通过双向验证，明确褪黑素是通过调控AMPK发挥的抗EMT作用。
3.3调控AMPK，观察其对褪黑素抗EMT过程中Smad3的影响，明确褪黑素通过激活AMPK，抑制Smad3磷酸化进而发挥的抗EMT作用。
3.4在体应用AMPK活性抑制剂，观察其对褪黑素抗气管移植后纤维化狭窄的影响。
3.5在正常16HBE细胞中，以及给予褪黑素处理的细胞EMT模型中，明确AMPK与SIRT3的上下游调控关系
研究结果：
1.褪黑素对原位气管移植后纤维化狭窄的影响
1.1本部分旨在明确大鼠气管移植术后不同时间节点的组织学变化。建立大鼠气管移植模型，分别在术后第3天，1周，2周，5周取气管组织进行检测，发现移植后3天和1周时气管移植段的粘膜损伤明显，伴有大量炎细胞浸润，从第2周开始，宿主气管上皮细胞开始增生、覆盖，气管固有层显著增厚，马松染色显示固有层出现胶原纤维沉积。
1.2本部分旨在探究褪黑素对在体气管移植后纤维化狭窄的影响。与假手术(Sham)组相比，移植(Allograft)组LCR值从第2周开始显著升高，第5周左右达到峰值，而联合应用褪黑素处理后LCR值相对下降。计算纤维化比值发现，相比假手术组，移植组的纤维化比值显著升高，而应用褪黑素处理后纤维化比值下降，提示褪黑素一定程度上抑制了气管移植后的纤维化增生。
1.3本部分拟从蛋白水平和mRNA水平检测EMT关键指标。结果显示，移植组TGF-β1、ZEB1、Snail1的mRNA和蛋白水平均显著升高，Smad3磷酸化水平升高。与移植组相比，移植+褪黑素处理组TGF-β1、ZEB1、Snail1的mRNA和蛋白水平均显著下调，伴有Smad3磷酸化水平下调，提示气管移植后发生了显著的EMT反应，而应用褪黑素处理一定程度上逆转了气管EMT。
1.4本部分首先构建16HBE细胞的EMT模型，进而给予褪黑素处理，以明确褪黑素的抗EMT作用。结果显示，TGF-β1处理后上皮标志分子E-cadherin显著下调而间质标志分子Vimentin、αSMA显著上调。相比TGF-β1处理组，联合应用褪黑素处理后E-cadherin表达上调，Vimentin、αSMA表达下调。Westernblot结果显示，褪黑素处理同时下调了Smad3的表达水平以及磷酸化水平。
2.SIRT3-GSK3β信号通路介导褪黑素抗EMT作用的机制研究
2.1转录组测序发现SIRT3mRNA在TGF-β1处理后表达下调，联合应用褪黑素处理后其mRNA水平回升，RT-PCR和Westernblot进一步验证了SIRT3的这一变化趋势。
2.2调控SIRT3表达，然后给予褪黑素处理，观察调控SIRT3对EMT标志分子和TGF-β1信号通路的影响。结果显示，SIRT3过表达增强了褪黑素的抗EMT作用，而SIRT3敲减则部分阻断了褪黑素的抗EMT作用。进一步检测TGF-β1信号通路关键分子发现，结果显示，SIRT3过表达后Snail1、Twist1、总Smad3水平下调，Smad3磷酸化水平无显著变化；SIRT3敲减后Snail1、Twist1、总Smad3水平升高，Smad3磷酸化水平也无显著变化。提示SIRT3可能通过调控Smad3表达水平影响TGF-β1信号通路。
2.3进一步探索SIRT3调控TGF-β1信号通路和EMT的内在机制，引入GSK3β的活性抑制剂TWS119。结果显示，SIRT3OE组Smad3水平下降，而联合应用TWS119后这一趋势被逆转。提示SIRT3引起的Smad3水平下降是GSK3β依赖的。
2.4建立大鼠气管原位移植模型，在体应用SIRT3活性抑制剂，结果显示，移植+褪黑素+3-TYP组的LCR值和纤维化比值都显著高于移植+褪黑素组，提示阻断SIRT3一定程度上逆转了褪黑素的抗气管移植后狭窄的作用。
3.AMPK介导褪黑素抗EMT作用的机制研究
3.1在体、离体实验均证实，AMPK在移植后的气管组织中磷酸化水平下降，联合应用褪黑素处理后磷酸化水平升高。
3.2本部分旨在明确AMPK对EMT过程的影响。结果显示，联合应用褪黑素和AMPK抑制剂削弱了褪黑素的抗EMT作用，而单独应用AMPK激动剂抑制了EMT进展。提示AMPK对EMT有明确的调控作用，是褪黑素调控EMT的中间靶点。
3.3本部分旨在明确AMPK对TGF-β1通路的核心因子Smad3的影响。结果显示，抑制AMPK活性上调了Smad3的磷酸化水平，而激活AMPK下调了Smad3的磷酸化水平，但是激活或抑制AMPK均未显著改变Smad3的总蛋白表达水平。
3.4建立大鼠气管原位移植模型，联合应用褪黑素与AMPK活性抑制剂ConpoundC处理。相比褪黑素处理组，褪黑素+CompoundC组的LCR值和纤维化比值都高升高。提示阻断AMPK一定程度上逆转了褪黑素的抗气管移植后狭窄的作用。
3.5在正常16HBE细胞中，以及给予褪黑素处理的EMT细胞模型中，AMPK与SIRT3之间没有发现明确的上下游调控作用，二者之间可能存在交互(cross-talk)作用。
研究结论：
1.褪黑素通过抑制气管上皮细胞EMT减轻气管移植后纤维化狭窄。
2.褪黑素通过激活SIRT3-GSK3β信号通路，促进Smad3降解进而抑制EMT。
3.褪黑素通过激活AMPK，抑制Smad3磷酸化水平进而抑制EMT。
4.AMPK与SIRT3-GSK3β信号通路之间可能存在交互(cross-talk)作用。
临床上因恶性肿瘤切除、外伤、气道梗阻等原因需要进行气管重建。气管移植是解决此类长段气管缺损的重要手段。近年来，同种异体气管移植研究取得了较大进展，但气管移植后发生气道梗阻的问题没有彻底解决，这依然是导致移植失败的主要原因。气管移植后狭窄的原因除软骨软化塌陷外，还与气管腔内的异常增生有关。其病理学基础是慢性的纤维组织增生，该过程包括纤维化效应细胞的增殖、分化和细胞外基质的过度沉积。研究显示，纤维化效应细胞来源包括骨髓的间充质干细胞、发生上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)的上皮细胞以及纤维化部位的成纤维细胞。在小鼠原位气管移植术后，宿主上皮细胞在增生、覆盖移植段气管的同时，发生了明显的EMT，提示上皮细胞的EMT在气管移植后气道重构中可能发挥重要作用。值得注意的是，Duan等发现丹参酮IIA可以通过抑制EMT，缓解气管移植后的纤维化狭窄，以上证据提示，调控气管移植后的EMT进展可能是缓解气管纤维化狭窄的有效手段。
褪黑素是一种吲哚类激素，负责调节睡眠和生物节律。新近研究发现褪黑素有多重生物学作用，如抗缺血、抗炎、调节代谢、抑制纤维化等。在纤维化研究领域，褪黑素已被证实参与调控心脏、肝脏、肾脏、肺组织等多种器官的纤维化过程。肺组织相关研究显示，褪黑素不但可以在离体水平抑制TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞EMT，还能从在体水平抑制肺泡上皮细胞EMT缓解博来霉素诱导的肺纤维化。然而褪黑素能否通过抑制气管上皮细胞的EMT来缓解气管移植术后的纤维化狭窄尚无研究报道。
沉默信息调控因子3(Silent information regulator 3，SIRT3)是NAD+依赖的脱乙酰化酶家族的一员，是线粒体内主要的乙酰化调节分子。SIRT3通过调控底物乙酰化，在线粒体抗氧化应激、解毒、调节三羧酸循环等过程中发挥重要作用。新近研究显示，SIRT3在心脏、肺脏、肝脏、肾脏等多个脏器的多种纤维化模型中有明确的调控作用。多项研究证实SIRT3是褪黑素的靶分子，SIRT3参与介导了褪黑素的抗缺血、抗纤维化等生物学作用。糖原合成酶激酶3β(Glycogensynthasekinase3，GSK3β)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，进化保守，参与调控细胞增殖、分化、纤维化、应激、凋亡等信号转导过程。值得注意的是，SIRT3可以脱乙酰化激活GSK3β，进而诱导Smad3降解，最终抑制肺组织EMT和纤维化进程。那么SIRT3/GSK3β信号通路是否参与了气管移植后的EMT过程尚不清楚。
AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶家族的一员，在各种器官和组织中都有表达。越来越多的证据表明，AMPK在纤维化过程中有明确的保护作用，可以参与调控包括心脏、肝脏、肺脏、肾脏、和皮肤在内的多个脏器或组织的纤维化。值得注意的是，褪黑素可以直接或间接激活AMPK，发挥抗心肌缺血再灌注损伤、调节脂代谢、维持卵巢功能、抑制肾纤维化等多重生物学作用。基于此，我们推测AMPK可能参与气管移植后的EMT过程。
综上，我们提出假设：褪黑素可能通过调控AMPK和(或)SIRT3-GSK3β进而抑制气管移植后的EMT，缓解气管移植后的纤维化狭窄。本项目将首先从离体和在体水平证实褪黑素的抗EMT作用；进而明确AMPK和(或)SIRT3-GSK3β在该过程中发挥的作用及具体机制。本研究希望进一步阐明气管移植后纤维化狭窄的分子机制，探索可能的抗纤维化靶点，为气管移植相关的基础和临床研究提供理论参考。
研究目的：
1明确褪黑素是否通过调控EMT发挥抗气管移植后狭窄的作用。
2明确褪黑素是否通过调控SIRT3-GSK3β发挥抗EMT作用。
3明确褪黑素是否通过调控AMPK发挥抗EMT作用。
研究方法：
1.褪黑素对原位气管移植后纤维化狭窄的影响
本部分实验拟首先从在体水平证实褪黑素抗气管移植后狭窄的作用；进而明确EMT是否参与了褪黑素抗气管移植后纤维化的过程；然后在细胞水平建立16HBE细胞的EMT模型，进一步验证褪黑素的抗EMT作用。
1.1建立大鼠气管原位移植模型，分别在术后第3天，1周，2周，5周取气管组织进行检测，初步明确移植后不同时间点气管的形态和组织学改变。
1.2将SD大鼠分为假手术组、气管移植组、气管移植+褪黑素处理组，于术后不同时间点处死大鼠，取气管组织进行HE染色、马松染色，计算LCR值和纤维化比值，明确褪黑素处理对气管移植后狭窄的影响。
1.3TGF-β1信号通路是调控EMT的核心通路。本部分拟从蛋白水平和mRNA水平检测褪黑素处理对移植后的气管组织中TGF-β1信号通路的影响。
1.4建立离体气管上皮细胞的EMT模型，进一步验证褪黑素的抗EMT作用。
2.SIRT3-GSK3β信号通路介导褪黑素抗EMT作用的机制研究
本部分拟首先通过RNA-seq筛选出褪黑素可能的调控靶点，然后通过调控其表达水平验证其介导了褪黑素的保护作用，进而阐明该分子介导褪黑素保护作用的具体机制，最后在大鼠气管移植模型中调控该分子表达或活性，观察其对褪黑素抗气管移植后狭窄的影响。
2.1转录组测序筛选褪黑素调控EMT的潜在靶点，并进行mRNA和蛋白水平验证。
2.2用Lenti-SIRT3OE慢病毒构建SIRT3稳定过表达的16HBE细胞株，用SIRT3siRNA下调SIRT3表达，分别这两种细胞建立EMT模型，给予褪黑素处理，检测EMT标志分子和TGF-β1信号通路分子，明确SIRT3介导了褪黑素的抗EMT作用。
2.3进一步探索SIRT3调控TGF-β1信号通路和EMT的内在机制，明确SIRT3通过激活GSK3β进而促进Smad3降解来抑制EMT。
2.4建立大鼠气管原位移植模型，在体应用SIRT3活性抑制剂，观察其对褪黑素抗气管移植后狭窄的影响。
3.AMPK介导褪黑素抗EMT作用的机制研究
本部分研究首先明确AMPK在褪黑素处理后的气管组织和气管上皮细胞中的激活情况，进而在细胞水平激活、抑制AMPK活性，观察其对褪黑素抗EMT作用的影响。最后在体应用AMPK抑制剂，观察其对褪黑素抗气管移植后纤维化狭窄的影响。
3.1检测气管移植后的气管组织中，以及发生EMT的16HBE细胞中AMPK的激活情况，证实AMPK可能参与了上述过程。
3.2抑制AMPK观察其对褪黑素抗EMT作用的影响，然后单独应用AMPK激动剂观察其对EMT过程的影响，通过双向验证，明确褪黑素是通过调控AMPK发挥的抗EMT作用。
3.3调控AMPK，观察其对褪黑素抗EMT过程中Smad3的影响，明确褪黑素通过激活AMPK，抑制Smad3磷酸化进而发挥的抗EMT作用。
3.4在体应用AMPK活性抑制剂，观察其对褪黑素抗气管移植后纤维化狭窄的影响。
3.5在正常16HBE细胞中，以及给予褪黑素处理的细胞EMT模型中，明确AMPK与SIRT3的上下游调控关系
研究结果：
1.褪黑素对原位气管移植后纤维化狭窄的影响
1.1本部分旨在明确大鼠气管移植术后不同时间节点的组织学变化。建立大鼠气管移植模型，分别在术后第3天，1周，2周，5周取气管组织进行检测，发现移植后3天和1周时气管移植段的粘膜损伤明显，伴有大量炎细胞浸润，从第2周开始，宿主气管上皮细胞开始增生、覆盖，气管固有层显著增厚，马松染色显示固有层出现胶原纤维沉积。
1.2本部分旨在探究褪黑素对在体气管移植后纤维化狭窄的影响。与假手术(Sham)组相比，移植(Allograft)组LCR值从第2周开始显著升高，第5周左右达到峰值，而联合应用褪黑素处理后LCR值相对下降。计算纤维化比值发现，相比假手术组，移植组的纤维化比值显著升高，而应用褪黑素处理后纤维化比值下降，提示褪黑素一定程度上抑制了气管移植后的纤维化增生。
1.3本部分拟从蛋白水平和mRNA水平检测EMT关键指标。结果显示，移植组TGF-β1、ZEB1、Snail1的mRNA和蛋白水平均显著升高，Smad3磷酸化水平升高。与移植组相比，移植+褪黑素处理组TGF-β1、ZEB1、Snail1的mRNA和蛋白水平均显著下调，伴有Smad3磷酸化水平下调，提示气管移植后发生了显著的EMT反应，而应用褪黑素处理一定程度上逆转了气管EMT。
1.4本部分首先构建16HBE细胞的EMT模型，进而给予褪黑素处理，以明确褪黑素的抗EMT作用。结果显示，TGF-β1处理后上皮标志分子E-cadherin显著下调而间质标志分子Vimentin、αSMA显著上调。相比TGF-β1处理组，联合应用褪黑素处理后E-cadherin表达上调，Vimentin、αSMA表达下调。Westernblot结果显示，褪黑素处理同时下调了Smad3的表达水平以及磷酸化水平。
2.SIRT3-GSK3β信号通路介导褪黑素抗EMT作用的机制研究
2.1转录组测序发现SIRT3mRNA在TGF-β1处理后表达下调，联合应用褪黑素处理后其mRNA水平回升，RT-PCR和Westernblot进一步验证了SIRT3的这一变化趋势。
2.2调控SIRT3表达，然后给予褪黑素处理，观察调控SIRT3对EMT标志分子和TGF-β1信号通路的影响。结果显示，SIRT3过表达增强了褪黑素的抗EMT作用，而SIRT3敲减则部分阻断了褪黑素的抗EMT作用。进一步检测TGF-β1信号通路关键分子发现，结果显示，SIRT3过表达后Snail1、Twist1、总Smad3水平下调，Smad3磷酸化水平无显著变化；SIRT3敲减后Snail1、Twist1、总Smad3水平升高，Smad3磷酸化水平也无显著变化。提示SIRT3可能通过调控Smad3表达水平影响TGF-β1信号通路。
2.3进一步探索SIRT3调控TGF-β1信号通路和EMT的内在机制，引入GSK3β的活性抑制剂TWS119。结果显示，SIRT3OE组Smad3水平下降，而联合应用TWS119后这一趋势被逆转。提示SIRT3引起的Smad3水平下降是GSK3β依赖的。
2.4建立大鼠气管原位移植模型，在体应用SIRT3活性抑制剂，结果显示，移植+褪黑素+3-TYP组的LCR值和纤维化比值都显著高于移植+褪黑素组，提示阻断SIRT3一定程度上逆转了褪黑素的抗气管移植后狭窄的作用。
3.AMPK介导褪黑素抗EMT作用的机制研究
3.1在体、离体实验均证实，AMPK在移植后的气管组织中磷酸化水平下降，联合应用褪黑素处理后磷酸化水平升高。
3.2本部分旨在明确AMPK对EMT过程的影响。结果显示，联合应用褪黑素和AMPK抑制剂削弱了褪黑素的抗EMT作用，而单独应用AMPK激动剂抑制了EMT进展。提示AMPK对EMT有明确的调控作用，是褪黑素调控EMT的中间靶点。
3.3本部分旨在明确AMPK对TGF-β1通路的核心因子Smad3的影响。结果显示，抑制AMPK活性上调了Smad3的磷酸化水平，而激活AMPK下调了Smad3的磷酸化水平，但是激活或抑制AMPK均未显著改变Smad3的总蛋白表达水平。
3.4建立大鼠气管原位移植模型，联合应用褪黑素与AMPK活性抑制剂ConpoundC处理。相比褪黑素处理组，褪黑素+CompoundC组的LCR值和纤维化比值都高升高。提示阻断AMPK一定程度上逆转了褪黑素的抗气管移植后狭窄的作用。
3.5在正常16HBE细胞中，以及给予褪黑素处理的EMT细胞模型中，AMPK与SIRT3之间没有发现明确的上下游调控作用，二者之间可能存在交互(cross-talk)作用。
研究结论：
1.褪黑素通过抑制气管上皮细胞EMT减轻气管移植后纤维化狭窄。
2.褪黑素通过激活SIRT3-GSK3β信号通路，促进Smad3降解进而抑制EMT。
3.褪黑素通过激活AMPK，抑制Smad3磷酸化水平进而抑制EMT。
4.AMPK与SIRT3-GSK3β信号通路之间可能存在交互(cross-talk)作用。