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川崎病（Kawasaki disease，KD）作为一种主要发生在5岁以下婴幼儿以全身血管炎为主要病变的急性发热出疹性疾病，广泛分布于全球，其中以亚裔患者最为常见。在我国发病率逐年上升，其危害主要表现为心血管系统损伤，包括冠脉损害、心脏病变和末梢动脉病变。研究认为感染因素激活免疫系统，导致大量炎症因子瀑布反应，介导血管内皮损伤及非特异性血管炎是其重要原因之一。KD的主要危害是冠脉损害（coronary artery lesions,CAL），组织病理证明KD患者冠状动脉管壁破坏显著，内皮细胞裸露，大量炎症细胞浸润。一系列研究证明内皮细胞损伤和功能障碍参与KD的血管损伤过程，但其发病机制迄今尚未阐明。近年来研究发现，微小RNA(microRNA)是通过完全或不完全互补配对的方式结合于靶mRNA的3UTR，导致靶基因的降解或者翻译抑制，参与多数基因表达调节，在心血管系统中miRNA对冠脉粥样硬化、心律失常、心肌梗死等疾病的发生和发展过程起到重要作用。此外，研究发现，miRNA在血循环中非常稳定，这一特性不但使miRNA非常适合作为血清标志物，而且可调控细胞功能。为此，本研究首先通过miRNA定量PCR芯片系统分析KD患者血清miRNA表达谱，筛选KD患者特异相关的循环miRNA，通过定量PCR加以验证，统计分析其表达与KD临床病理特征相关性，确定CAL相关的miRNA,并分析候选miRNA对血管内皮细胞的功能的调节及机制。本研究不但可进一步阐明KD发生发展机制，且为寻找新的防治靶点提供基础。 目的: 筛选、验证KD特异相关血清miRNA，研究其作为KD及CAL诊断血清标志物的意义；分析CAL相关的miRNA对血管内皮细胞生物学功能的影响及靶基因，进一步探讨KD的发病机制。 方法： 收集KD患儿急性期与恢复期、健康对照及发热儿童血清标本及临床资料，通过miRNA定量PCR芯片比较KD患儿和健康对照组血清miRNA的表达，筛选KD特异相关的血清miRNA，通过实时定量PCR方法验证候选miRNA的差异表达，并通过ROC曲线评估其作为疾病标记物的诊断意义；通过miRNA mimic/inhibitor上调/下调人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）内CAL相关的候选miRNA（miR-23a与miR-146a），利用CCK-8、细胞划痕、Transwell、流式细胞技术等检测HUVECs基本生物学功能的影响；利用人炎症细胞因子芯片和EILSA法检测，确定miR-23a与miR-146a干预对HUVECs细胞因子表达的影响；采用TargetScan、miRDB等生物信息学软件分析靶基因，结合功能分析筛选候选靶基因，最后通过荧光素酶报告系统、蛋白印迹实验（WB）验证靶基因，明确候选miRNA的调控机制。 结果： miRNA定量PCR芯片检测发现，相对于健康对照标本血清，128条miRNA在KD患儿血清中存在明显差异表达，其中1条下调，127条上调。根据Ct值、差异倍数及疾病关联程度进行筛选，筛选到12条KD相关的血清候选miRNA(分别为hsa-miR-221，hsa-miR-146a，hsa-miR-27a，hsa-miR-19b，hsa-let-7i，hsa-let-7g，hsa-miR-16，hsa-miR-23a，hsa-miR-92a，hsa-miR-21，hsa-miR-20a，hsa-miR-451)。以cel-miR-39为外参基因，通过Real-time PCR证实其中4条miRNA（miR-92a，miR-146a，miR-23a，miR-21）在KD急性期患儿血清中相对表达量明显高于发热儿童、健康儿童对照组血清及KD恢复期血清（P＜0.05）。ROC曲线显示，miR-92a,miR-146a，miR-23a和miR-21等4条miRNA均可用于KD的诊断，其曲线下面积分别为0.760（CI95%：0.686-0.834）,0.854(CI95%：0.789-0.918),0.853（CI95%：0.785-0.922）和0.747（CI95%：0.667-0.827）。进一步临床病理特征相关分析显示，血清miR-23a和miR-146a表达水平与KD的CAL相关。 进一步评估CAL相关的miRNA(miR-23a和miR-146a)干预对血管内皮细胞功能的影响，结果显示，HUVECs细胞转染miR-23a mimics后可促进细胞增殖和迁移，抑制凋亡，而转染miR-23a inhibitor抑制细胞增殖和迁移，促进凋亡；转染miR-146a mimics可抑制细胞的增殖、促进细胞凋亡和迁移，而转染miR-146a inhibitor促进细胞增殖、抑制细胞凋亡和迁移。炎症细胞因子定量PCR芯片结合细胞因子ELISA检测显示，调节HUVECs细胞内miR-23a与miR-146a表达水平可明显影响HUVECs中IL-6、IL-8、TGF-β1、IL-1β多种炎症细胞因子的表达（P＜0.05）。但miR-23a及miR-146a生物信息学预测的靶基因中未见受影响的炎症细胞因子。由于NF-κB通路是调节炎症细胞因子表达重要机制，为此本研究选择可影响NF-κB的候选靶基因（TNFAIP3和TRAF6），进行荧光素酶报告系统证实。结果显示，共转染miR-23amimics和NF-κB抑制因子TNFAIP3（A20）3’UTR质粒的相对荧光素酶活性较过表达miR-23a mimics对照组（NC）组明显降低（P＜0.05），而共转染miR-23a mimics和A203’UTR突变质粒的细胞相对荧光素酶活性与NC组无显著差异。荧光素酶报告系统也证实，miR-146a调控的靶基因为TRAF6。另外，WB实验进一步证明，miR-23a mimics干预可明显下调A20表达，miR-146a mimics干预明显下调TRAF6的表达。 结论： 1.KD患者急性期与健康对照人群之间存在大量血清miRNA差异表达，其中血清miR-92a，miR-146a，miR-23a，miR-21可作为KD良好的诊断标志物，而且血清miR-23a、miR-146a上调表达还与KD的CAL相关。 2.调节细胞内miR-23a、miR-146a表达可影响血管内皮细胞增殖、迁移、凋亡、细胞因子表达等，提示miR-23a、miR-146a可参与血管内皮细胞的损伤及功能紊乱。 3.NF-κB信号通路调节蛋白A20及TRAF6分别是miR-23a和miR-146a调控靶基因，参与了miR-23a、miR-146a对血管内皮细胞细胞因子表达的影响。