乳腺癌是中国女性发病率最高的恶性肿瘤,且发病率逐年上升,每年新发和死亡数量分别占全世界新发和死亡数的12.2%和9.6%,乳腺癌一旦发生远处转移,10年生存率不足10%。目前研究较热的是乳腺癌的靶向治疗,被认为是将来最有前途的治疗方式,而目前缺乏明确的靶点和有效药物,因此寻找新的靶点进而阻断乳腺癌的侵袭转移是乳腺癌治疗亟待解决的问题。研究显示,乳腺癌的发生发展以及转移是多种因素共同作用的结果,其中与蛋白质降解紊乱密切相关。泛素-蛋白酶体系统参与完成细胞内绝大部分蛋白质的降解,是非常重要的系统。许多研究表明,泛素-蛋白酶体系统在恶性肿瘤发生和转移过程中起着重要作用。目的:作为去泛素化酶家族的主要类型,泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin-Specific Protease,USP)与乳腺癌的发生以及晚期的转移密切相关。多种USP在乳腺癌组织中已经被发现并且被证实呈高表达状态,它们参与乳腺癌的增殖、转移,以及与晚期乳腺癌不良预后呈正相关。USP4在多种肿瘤组织中高表达并被称为癌基因。目前ONCOMINE、Kaplan Meier-plotter数据库是大家所公认的公共数据库,它整合了癌症芯片数据库并与网络结合的数据平台,包含已发表的各类文献和TCGA等来源的RNA和DN A序列的数据其目的在于促进发现全基因组表达分析。2个数据库检测了大约人类4800万个基因,可对比最主要的癌症类型和各自的正常组织的差异性表达分析,以及各种癌症亚型分类和临床及病理学的分析,能促进发现新的生物标志物和治疗靶点。该数据库对于研究某个基因在疾病中的作用具有重要参考价值。因为乳腺癌的分子分型目前临床上应用较为广泛,所以我们通过2个数据库研究USP4基因在乳腺癌中的表达,及USP4与分子分型的关系,从而可以指导乳腺癌患者的治疗方案,预示了乳腺癌患者的预后。TGF-β/Smad信号通路的异常活化与肿瘤的发生发展密切相关,尤其在肿瘤的侵袭转移过程中发挥重要作用。最新研究发现TGF-β受到泛素化修饰,影响该信号通路的活化,USP家族也参与TGF-β信号通路的去泛素化修饰,其中USP4可通过调控转化生长因子受体1(TβR1)去泛素化,增强TGF-β信号通路活性,诱导乳腺癌细胞的上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)和侵袭迁移。研究发现,USP4能够提高SMAD2的磷酸化和TGF-β基因的转录。但USP4如何调控TGF-β信号通路,如何调节乳腺癌侵袭和转移的具体机制尚不清楚。松弛素近年来发现除了对生殖系统和心血管系统的各种作用外,对肿瘤的发生发展的作用逐渐被发现。有研究发现实体肿瘤的细胞外基质通过阻断肿瘤外的药物扩散浓度影响治疗的有效性,通过检测在肿瘤内的多肽激素松弛素的表达能够提高细胞外基质的降解和提高曲妥珠单抗治疗的有效性。当联合松弛素进行曲妥珠单抗治疗后,能显著抑制肿瘤生长。也有研究发现松弛素是TGF-β1介导的胞外基质合成和分泌的抑制物,跟成纤维细胞活化一样起到作用。另外,它通过TGF-β1信号路径介导MMP2、MMP-9降低了胞外基质的分泌。还有研究发现松弛素在乳腺癌患者血清中浓度水平增高,尤其是转移患者松弛素水平升高更为显著,与预后成负相关,其中松弛素2过度表达对细胞增殖存在正相关,与TGF-β、调控纤维化等都具有一定的关联。因目前对USP4影响乳腺癌侵袭和转移的机制尚没有形成统一定论,所以我们深入研究USP4与松弛素及TGF-β1/Smad2/MMP-9路径的关系,将为临床乳腺癌患者的治疗提供新的思路和希望。方法:1、通过ONCOMINE数据库分析USP4基因在乳腺癌组织及正常乳腺组织中的表达差异情况。通过Kaplan Meier-plotter网站分析USP4基因与乳腺癌患者5年和10年OS的差异。2、实时荧光定量PCR检测乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞、T47D细胞和正常乳腺上皮细胞MCF-10A细胞中USP4的表达量。3、通过si RN A干扰技术建立静默USP4基因的MDA-MB-231细胞;通过质粒转染技术建立过表达USP4基因的T47D细胞。然后分别利用RT-PCR和Western Blot方法检测USP4的m RNA及蛋白表达情况。用Transwell侵袭实验及划痕实验检测静默或过表达USP4基因对乳腺癌细胞侵袭和迁移能力生物学行为的影响。然后分别检测静默USP4基因MDA-MB-231细胞和过表达USP4基因T47D细胞中MMP-9蛋白的表达,并在过表达USP4基因T47D细胞中加入MMP-9抑制剂BB94,通过Transwell侵袭实验及划痕实验检测其侵袭和迁移生物学行为的能力的变化。4、在过表达USP4基因T47D细胞中用si RNA技术分别导入Si Relaxin 2、Si TGF-β1、Si Smad2,通过Western Blot检测静默了这三种基因后Relaxin 2、TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白表达水平变化;通过Transwell侵袭实验、划痕实验检测分别静默Relaxin 2、TGF-β1、Smad2基因后对细胞侵袭迁移生物学行为的影响。结果:1、通过包含全基因组的ONCOMINE数据库分析显示:USP4基因在乳腺癌组织中表达明显高于正常乳腺组织中(p<0.001)。通过Kaplan Meier-plotter网站分析USP4基因在HER-2阳性乳腺癌患者中5年OS差异有统计学意义(p=0.042),在其它分子分型的乳腺癌并没有看出生存劣势。2、USP4在乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞、T47D细胞中高表达,在乳腺正常上皮细胞MCF-10A细胞中低表达,p<0.05,差异具有统计学意义。3、通过RT-PCR和Western blot实验证实能够成功建立静默USP4基因MDA-MB-231细胞。4、划痕实验显示:静默USP4基因MDA-MB-231细胞48 h后划痕宽度显著大于阴性对照组(p<0.05);侵袭实验显示:静默USP4基因MDA-MB-231细胞48 h后侵袭细胞数显著少于阴性对照组(p<0.05)。5、通过RT-PCR和Western blot实验证实能够成功建立质粒转染过表达USP4基因T47D细胞。划痕实验显示:过表达USP4基因T47D细胞48 h后划痕宽度显著小于阴性对照组(p<0.05),侵袭实验显示:过表达USP4基因T47D细胞24 h后侵袭细胞数显著多于阴性对照组(p<0.05)。6、对过表达USP4基因的T47D细胞进行Relaxin2、TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白的检测,结果显示:Relaxin2、TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白表达明显提高。对静默USP4基因的MDA-MB-231细胞进行Relaxin2、TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白的检测,结果显示TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白表达均显著下降。提示USP4的表达影响Relaxin2、TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白的表达。7、我们利用si RNA干扰技术对过表达USP4的T47D细胞分别进行Smad2、TGF-β1基因的静默,然后用Western blot实验对其分别进行Relaxin2、TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白的检测,结果发现:阻断Smad2基因后的过表达USP4的T47D细胞,其Smad2、MMP-9蛋白表达与对照组相比明显下调,却没有影响Relaxin2蛋白的表达。阻断TGF-β1基因后的过表达USP4的T47D细胞,其TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白的表达与对照组相比均明显下调,也没有影响Relaxin2蛋白的表达。8、我们通过si RNA干扰技术对过表达USP4的T47D细胞进行Relaxin2基因的干扰,然后用Western blot实验对其进行检测,结果显示:过表达USP4的T47D细胞静默Relaxin2基因后,其TGF-β1、Smad2和MMP-9蛋白的表达与对照组相比都是显著降低。9、Western blot结果显示:静默USP4基因MDA-MB-231细胞中MMP-9蛋白表达较阴性对照组显著降低(p<0.05),而在USP4过表达的T47D细胞中MMP-9蛋白表达较阴性对照组表达显著增加(p<0.05)。对过表达USP4的T47D细胞应用MMP-9的抑制剂BB94进行处理后划痕试验结果显示,BB94处理的T47D细胞的划痕宽度显著大于未处理组(p<0.05)。Transwell侵袭实验结果也表明BB94处理的过表达USP4基因T47D细胞的侵袭细胞数目显著少于未处理组(p<0.05),这提示USP4促进乳腺癌细胞的侵袭能力也能够被MMP-9的抑制剂抑制,MMP-9在USP4促进乳腺癌细胞侵袭和迁移中发挥作用。10、对USP4过表达的T47D细胞分别静默Relaxin2、TGF-β1和Simad2基因后,进行划痕实验,结果显示:Si Relaxin2组、Si TGF-β1组、Si Smad2组划痕宽度与对照组相比均明显增宽,迁移能力明显下降(*p<0.05),其中Si Relaxin2组划痕宽度最大,差异有统计学意义(**p<0.01)。对USP4过表达的T47D细胞分别静默Relaxin2、TGF-β1和Simad2基因后,进行Transwell侵袭实验,结果显示:Si Relaxin2组、Si TGF-β1组、Si Smad2组侵袭细胞数目与对照组相比均明显减少,侵袭能力明显下降(*p<0.05),其中Si Relaxin2组侵袭细胞数目最少,差异有统计学意义。(**p<0.01)结论:1.USP4能够促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭;2.MMP-9参与USP4影响乳腺癌细胞的侵袭和迁移的过程;3.USP4通过激活TGF-β1/Smad2信号通路促进MMP-9的表达,USP4通过TGF-β1/Smad2/MMP-9信号通路促进乳腺癌细胞的侵袭迁移;4.USP4影响Relaxin2的表达,USP4通过Relaxin2介导的TGF-β1/Smad2/MMP-9信号通路促进乳腺癌的侵袭迁移;5.抑制TGF-β1信号通路、抑制MMP-9的功能或静默USP4基因将有望成为治疗乳腺癌的新方法。