实验目的骨骼肌损伤后修复是运动医学研究的热点问题,骨骼肌具有很强的再生能力以应对轻微损伤,但严重损伤可导致广泛且不可逆的纤维化,瘢痕形成和肌肉功能丧失。如何提高骨骼肌损伤后的再生修复能力,促使病人尽早康复仍是研究的难点。因此,研究骨骼肌再生修复机制,可以为骨骼肌损伤修复提供理论基础,有助于临床骨骼肌损伤的治疗。本课题主要利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除LRTM1(Leucine-rich repeats and transmenbrane domains 1)基因的C2C12细胞系,研究Lrtm1对C2C12细胞成肌分化的作用及作用机制。研究方法利用CRISPR/Cas9系统将C2C12细胞中LRTM1基因稳定敲除,挑选敲除LRTM1的单克隆细胞,构建稳定敲除LRTM1的C2C12细胞株;诱导敲除LRTM1稳定细胞株成肌分化,Western blot和RT-PCR检测成肌分化标志因子Myosin和MyoG的表达;CCK8实验检测细胞敲除LRTM1后细胞的增殖情况;Western blot检测敲除LRTM1后C2C12细胞中p-ERK水平,以及ERK下游CyclinD1/CDK4的表达;Western blot检测MAPK/ERK通路中p-MEK、p-RAF以及p-SHC水平在敲除LRTM1后的变化情况。实验结果测序结果显示C2C12细胞系中稳定敲除LRTM1基因;敲除LRTM1后能明显抑制细胞成肌分化,并且成肌分化标志因子Myosin和MyoG的表达明显降低;CCK8结果显示敲除LRTM1后能促进细胞增殖,并且Western blot结果显示p-ERK以及ERK下游CyclinD1/CDK4在敲除LRTM1后表达增加;MAPK/ERK通路中p-MEK、p-RAF和p-SHC水平,在敲除LRTM1后增加。研究结论1.稳定敲除LRTM1基因的C2C12细胞系构建成功。2.敲除LRTM1后能抑制C2C12细胞的成肌分化,并且促进细胞的增殖。3.敲除LRTM1后细胞成肌分化抑制的原因可能为CyclinD1/CDK4表达增加抑制了成肌转录因子MyoD的转录活性。4.CyclinD1/CDK4表达增加的原因为p-ERK水平增加。5.敲除LRTM1后能使MAPK/ERK通路异常激活,LRTM1的作用可能为抑制MAPK/ERK通路。