血管移植物感染(vascular graft infection,VGI)是血管外科严重并发症之一。此并发症一旦发生,治疗非常棘手,不管采用内科保守治疗还是外科手术治疗,其预后均不良(死亡、截肢、再感染)。近年来,随着血管移植物的广泛应用,血管移植物感染作为一个突出的问题已受到关注,研制具有抗感染活性的血管移植物也因此成为热点。国外学者已研究表明抗生素载药所制备的血管移植物能有效地抵御感染,因为这样可以在移植物表面和移植物周围组织维持一段时间较高的抗生素浓度。 然而,目前研制的抗生素载药移植物仍然存在问题: 1.抗菌活性维持时间短暂。 2.抗生素选择未达成共识。 理想的载药应该维持足够长的时间,既能防止早期 VGI,又能防止后期VGI;理想的载药抗生素应该对引起血管移植物感染的大部分致病菌有效,并且不产生耐药。 为了研制理想的抗感染血管移植物,我们对移植物的载药工艺和抗生素的抗菌特性进行探讨,筛选对 G+细菌具有强大抗菌作用的去甲万古霉素为模型药物,制备了具有持久抗菌活性的载药涤纶血管材料,并进一步以耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为试验菌设计体外和体内抗菌试验,证实其预防血管移植物感染的有效性。研究共分三部分: 1.去甲万古霉素载药涤纶血管材料的制备 1)建立载药血管材料去甲万古霉素含量和释药量测定的 HPLC 法。 2)以聚乳酸为载体制备去甲万古霉素聚乳酸缓释微球(NV-PLA-MS)。 3)以乙烯-醋酸乙烯共聚物为支撑剂将 NV-PLA-MS 固载至涤纶材料 表面制备去甲万古霉素载药涤纶血管材料(NV-DP)。 4)用肉眼和显微镜考察 NV-DP 的形态特征。 5)用 HPLC 法测定 NV-DP 载药量。长海医院血管外科 - 1 -<WP=6>博士学位论文 去甲万古霉素载药涤纶血管材料预防血管移植物感染 摘要6)用 HPLC 法考察 NV-DP 体外释药行为。7)用 GC 法测定 NV-DP 中有机溶剂二氯甲烷残留量。2.去甲万古霉素载药涤纶血管材料体外抗菌活性测定1)以耐甲氧西林表皮葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌为试验 菌。模拟生理条件实现血管材料体外药物释放,将每片直径 6mm 的圆形空白涤纶材料和载药涤纶材料放入 10ml 磷酸盐缓冲生理盐 水,置 37℃水浴摇床 100r/min 振荡;分别于 0、7、14 和 28 天取 出,移入含 0.5ml 上述两种细菌菌液的 10ml 肉汤中;置于 37℃温 箱中培养 48 小时。2)取出上述培养液并移种至血平板进行菌落计数。3)统计分析,对载药涤纶材料细菌培养液和空白涤纶材料细菌培养液 的菌落数进行比较。3.去甲万古霉素载药涤纶血管材料预防腔内血管移植物感染动物实验研究1)空白涤纶血管材料及载药涤纶血管材料缝至自膨式镍钛血管腔内 支架表面构建腔内血管移植物。2)将上述腔内血管移植物浸泡于浓度 2×107 CFU/ml 的表皮葡萄球菌 或金黄色葡萄球菌悬液中 15 分钟,造成移植物染菌,再通过腔内 途径植入杂种犬肾下腹主动脉,建立动物模型。3)移植物植入后 14 天处死动物,取出标本,进行肉眼、细菌学、组 织学检查。最终结果评定指标是移植物感染。4)统计分析,对载药移植物和空白移植物的感染发生率进行比较。研究结果显示:1.NV-PLA-MS 平均粒径为 30.7μm,载药量为 0.2533±0.0025g/g;微球被成功地固载至涤纶材料表面,载药量为 0.2465±0.0006g/cm2,制备的载药血管材料厚度均匀(0.18mm),表面光整;去甲万古霉素从 NV-DP上缓慢释放超过 20 天,符合双相动力学规律,前 10 天为快速释药长海医院血管外科 - 2 -<WP=7>博士学位论文 去甲万古霉素载药涤纶血管材料预防血管移植物感染 摘要(80%),其后为缓慢释药。有机溶剂二氯甲烷的残留小于 0.06%。2.浸泡释放 0、7、14 和 28 天后各 NV-DP 细菌混合培养液的菌落数显著少于空白移植物-细菌混合培养液。3.由载药涤纶血管材料构建的腔内血管移植物未出现由两种细菌引起的血管移植物感染,而由空白涤纶血管材料构建的腔内血管移植物 MRSE沾染后的感染率为 83.3%(5/6)、MRSA 沾染后的感染率为 100%(6/6)。根据以上结果,得结论如下:1.NV-PLA-MS 固载至涤纶血管材料表面制备的 NV-DP 厚度均匀,壁薄,载药量大,在体外能够实现长时间药物缓释,有机溶剂残留未超标,提示:该载药血管材料适合用于制备抗感染血管移植物。2.体外试验证实 NV-DP 对 MRSE 和 MRSA 的抗菌作用可持续维持 28 天,提示:该血管移植物具有比较持久的抗感染活性。3.活体动物实验结果显示 NV-DP 能完全抑制 MRSE 和 MRSA 的生长,证明了该载药血管材料能有效地预防由 MRSE 和 MRSA 引起的腔内血管移植物感染。