背景与目的乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌的发生与多种癌基因激活或抑癌基因失活有关。尤其是一些与细胞生长及内分泌相关的基因,如HER2、ERK、ERa等。因此,目前在临床治疗中使用了许多靶向这些特异性基因的药物,如赫赛汀、他莫西芬等,取得了较好的疗效。但随着这些药物的广泛使用,耐药性逐渐成为限制其疗效的关键因素。赫赛汀是靶向HER2的一类临床一线治疗用药,它可与乳腺癌细胞表面的HER2受体特异性结合,从而阻止HER2受体发生二聚化而激活,进而抑制了其介导的下游信号通路,产生抗瘤效应。但赫赛汀单独用药的客观反应率并不高,只有12%-34%,且近50%的患者在使用赫赛汀的初期就会产生耐药性,因此,深入阐明乳腺癌细胞对曲妥珠单抗耐药的相关机制并采取针对性的措施成为目前乳腺癌治疗中的重要科学问题。由于曲妥珠单抗所封闭的靶分子HER2为乳腺癌细胞表面的一类受体,该受体激活后可引起细胞内多条信号通路的活化,包括Ras/MAPK信号通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路、JAK/STAT信号通路以及PLC-y信号通路等。这些信号通路的异常和乳腺癌的增殖、生长等密切相关。因此,曲妥珠单抗治疗过程所产生的耐药性也往往和相关信号通路异常密切相关。研究表明,HER2信号通路中任一环节发生改变,都可能导致曲妥珠单抗治疗抵抗。目前已发现的抵抗机制包括：HER家族受体与胰岛素样生长因子1受体(insu-lin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R)信号增加；HER2截短突变体p95-HER2的累积；PI3K/AKT/mTOR信号通路的异常活化。除了这些可能导致HER2阳性乳腺癌细胞对曲妥珠单抗治疗抵抗的机制外,JAK/STAT通路的激活也可能是引起抵抗的另一重要机制,但目前相关报道很少。JAK是一类非受体型酪氨酸激酶,该家族包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2四个成员。JAK激活后可以磷酸化STAT而使后者活化,从而构成JAK/STAT信号通路。JAK/STAT信号通路在多种肿瘤组织中均存在过度激活的现象。在乳腺癌组织中,总的STAT3与磷酸化STAT3的表达水平均显著高于正常乳腺组织,且与肿瘤的侵袭转移程度密切相关。但STAT3的激活是否与乳腺癌细胞对曲妥珠单抗的治疗抵抗有关目前尚未见报道。因此,本研究拟首先以HER2阳性的乳腺癌细胞为研究对象,观察曲妥珠单抗处理过程中STAT3的激活情况,并利用基因沉默技术及特异性抑制剂联合曲妥珠单抗处理来观察细胞的反应,从而判断STAT3的激活在乳腺癌细胞耐受曲妥珠单抗中的作用,以期为进一步的临床治疗提供理论基础与科学依据。AG490是目前研究中常用的一种JAK/STAT通路特异性抑制剂。AG490可以竞争性结合酪氨酸激酶JAK2,从而抑制其活性。AG490抑制JAK的激活后,导致STAT3磷酸化被抑制,造成STAT3不能入核与相关DNA元件结合,从而抑制肿瘤细胞的增殖。当前,AG490已成为临床治疗多种肿瘤的抗癌药物,但AG490能否增敏曲妥珠单抗尚不清楚。另外,由于激活的STAT3能上调抗凋亡基因Bcl-xL、Bcl-2 与 Mcl-1的表达,激活促血管生成生长因子VEGF的表达,还能上调细胞周期调节蛋白cyclins D1/D2以及促细胞增殖蛋白c-myc与Survivin的表达,并且有下调促凋亡基因p53表达的作用。尤其最近研究发现,抑癌基因SARI也可能参与了JAK/STAT信号介导的肿瘤发生。SARI又称为BATF2,在正常人组织中表达水平较高,而在相应的肿瘤细胞中表达水平降低。外源性表达SARI可以抑制肿瘤细胞的增殖,而过表达SARI却对正常细胞无明显的增殖抑制效应。但SARI抗癌的分子机制还没完全清楚,特别是调控SARI表达的上游信号还不清楚。AG490作用后是否可通过激活SARI来杀伤乳腺癌细胞也值得进一步探讨。方法通过CCK-8实验测定不同浓度的曲妥珠单抗对HER2阳性细胞SK-BR3增殖的抑制作用,通过台盼蓝染色实验测定不同浓度的曲妥珠单抗对HER2阳性细胞SK-BR3死亡的影响,通过克隆形成实验测定不同浓度的曲妥珠单抗对HER2阳性细胞SK-BR3克隆形成能力的影响,通过免疫印迹实验检测曲妥珠单抗作用后SK-BR3细胞中STAT3的激活情况,然后通过siRNA沉默SK-BR3细胞中的STAT3,免疫印迹实验确定沉默效果,然后通过CCK-8实验和台盼蓝实验观察沉默STAT3后曲妥珠单抗对SK-BR3细胞增殖与死亡的影响。再进一步使用STAT3抑制剂AG490单独或与曲妥珠单抗联合处理SK-BR3细胞,通过CCK-8实验和台盼蓝实验观察不同处理对细胞增殖与死亡的影响。然后采用相同的策略,通过CCK-8实验测定不同浓度的AG490分别对HER2阳性与HER2阴性细胞增殖的抑制作用,通过台盼蓝染色实验测定不同浓度的AG490分别对HER2阳性与HER2阴性细胞死亡的影响,通过克隆形成实验测定不同浓度的AG490分别对HER2阳性与HER2阴性细胞克隆形成能力的影响,通过免疫印迹实验检测AG490作用后细胞中SARI的激活情况,然后通过siRNA沉默细胞中的SARI,免疫印迹实验确定沉默效果,然后通过CCK-8实验和台盼蓝实验观察沉默SARI后AG490对细胞增殖与死亡的影响。通过生物信息方法预测SARI基因启动子区中存在的STAT3结合位点,并采用PCR方法从乳腺癌细胞中扩增SARI基因的启动子区,并针对性的扩增包含或不包含STAT3结合位点的片段,将各片段插入报告基因载体pGL3中,然后转染细胞,观察AG490处理前后荧光素酶活性变化情况,从而确定AG490是否能够通过上调SARI的转录来增强其表达并抗癌。结果曲妥珠单抗能以剂量依赖的方式抑制SK-BR3细胞的增殖,0.25、0.5、1.0、2.0,4.0 mg/ml曲妥珠单抗的细胞相对增殖率分别为76.22%、72.97%、61.08%、42.16%和23.78%。曲妥珠单抗也能以剂量依赖的方式促进SK-BR3细胞死亡0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 m//ml曲妥珠单抗相对应的细胞死亡率分别为：10.35+1.66%、18.37+2.49%、31.97±3.08%、46.78±5.67%、63.77±7.81%。与对照组相比,曲妥珠单抗还能以剂量依赖的方式抑制SK-BR3细胞的克隆形成,0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml曲妥珠单抗相对应的细胞克隆形成率分别为：64.79+8.38%、35.21±13.29%、26.03±10.79%、16.29±10.34%、6.18±6.06%。曲妥珠单抗还可以浓度依赖性地激活SK-BR3细胞中的STAT3信号通路,体现为磷酸化STAT3水平显著升高。用特异性siRNA沉默SK-BR3细胞中的STAT3后,CCK-8实验分析发现可以显著增强曲妥珠单抗对SK-BR3细胞的增殖抑制率,台盼蓝实验分析发现可以显著增加曲妥珠单抗对SK-BR3细胞的死亡率。CCK-8实验结果表明,与AG490单独处理组或曲妥珠单抗单独处理组相比,AG490联合曲妥珠单抗可以显著增加SK-BR3细胞的增殖抑制率；台盼蓝实验结果也表明,与AG490单独处理组或曲妥珠单抗单独处理组相比,AG490联合曲妥珠单抗可以显著增加SK-BR3细胞的死亡率。本研究结果进一步证明,抑制STAT3信号通路确实可以增加曲妥珠单抗对SK-BR3细胞的杀伤率。AG490能以剂量依赖的方式抑制SK-BR3细胞与MDA-MB-231细胞的增殖,AG490在两种细胞中的IC50值分别为43.281 μM与28.327μM。 AG490也能以剂量依赖的方式促进SK-BR3细胞与MDA-MB-231细胞死亡,SK-BR3细胞的对照组死亡率为1.02+0.24%,AG490处理组按照浓度梯度升高(25、50、100 μM)关系相对应的死亡率分别为：5.78±1.67%、16.89+2.67%、31.08±4.65%；而在MDA-MB-231细胞,对照组死亡率为1.77+0.66%,AG490处理组按照浓度梯度升高(25、50、100 μM)关系相对应的死亡率分别为：8.05+2.05%、27.26±2.89%、44.18±4.98%。与对照组相比,AG490还能以剂量依赖的方式抑制SK-BR3细胞与MDA-MB-231细胞的克隆形成。在SK-BR3细胞,对照组与实验组(依浓度升高)的细胞克隆数分别为：559±52、361+38、206±29、117±15个；在MDA-MB-231细胞,对照组与实验组(依浓度升高)的细胞克隆数分别为：389±42、211+23、149±17、68±13个。定量PCR检测发现,随AG490处理浓度的升高,SK-BR3与MDA-MB-231细胞中SARI的mRNA水平均显著升高；Western blot分析也进一步证实,AG490可以剂量依赖的方式增强SK-BR3与MDA-MB-231细胞中SARI蛋白的表达水平。沉默SARI后AG490对MDA-MB-231细胞的增殖抑制效应降低。生物信息学分析发现,在位于-1787到-1797位置存在1个经典的STAT3结合位点。将包含SARI启动子区不同大小的两个片段(-1到-2000bp,-1到-1700bp)分别克隆到报告质粒pGL3-basic中,并与对照质粒同时转染MDA-MB-231细胞后进行荧光素酶报告基因检测,发现不含STAT3结合位点的-1到-1700bp片段在AG490处理前后荧光素酶活性无明显改变,而包含该结合位点的-1到-2000bp片段则在AG490处理后荧光素酶活性显著增高。这一结果说明AG490作用后可通过增加SARI启动子活性而增强SARI的转录来提高其表达,这一过程可能与AG490对STAT3的抑制及STAT3对SARI启动子活性的抑制相关。结论1.曲妥珠单抗可以剂量依赖性地抑制HER2阳性乳腺癌细胞的增殖、促进其死亡、并抑制其细胞克隆的形成。2.曲妥珠单抗处理导致HER2阳性乳腺癌细胞中STAT3的激活,沉默STAT3或抑制STAT3的活性均能增强HER2阳性乳腺癌细胞对曲妥珠单抗的敏感性。3.AG490可以剂量依赖性地分别抑制HER2阳性与HER2阴性乳腺癌细胞的增殖、促进其死亡、并抑制其细胞克隆的形成。4.AG490处理导致HER2阳性与HER2阴性乳腺癌细胞中SARI表达上调,沉默SARI后能降低乳腺癌细胞对AG490的敏感性。5.SARI基因的启动子区存在STAT3的结合位点,不含该结合位点的启动子片段被AG490激活的能力要显著低于野生型启动子的受激活能力。意义1.STAT3的激活是导致HER2阳性乳腺癌细胞对曲妥珠单抗耐受的重要机制。2.AG490能有效增强HER2阳性乳腺癌细胞对曲妥珠单抗的敏感性。3.AG490杀伤乳腺癌细胞与其对抑癌基因SARI的转录上调作用相关。