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研究背景随着载人航空事业的发展,太空失重导致的骨质疏松越来越受到科学家的关注,空间飞行试验积累的资料已经总结出,失重性骨质稀少的主要原因是骨形成的减少而不是骨吸收的增强。成骨细胞是骨形成、发育和生长过程中的重要细胞。以往的研究热点主要集中在微重力对成骨细胞分化过程的影响,随着细胞学研究的发展,对于失重性骨质疏松的研究渐渐聚集在细胞分子水平的探索。对微重力条件下,成骨细胞感受和传导机械应力的结构、细胞信号转导及基因表达等发生的变化都取得了一定的进展。大量研究发现,微重力导致细胞分化成熟相关物质(碱性磷酸酶,骨钙素和Ⅰ型胶原)的mRNA表达及蛋白合成减少,还导致成骨细胞COX-2的基因表达下调及PGE2和NO分泌量增加。也有研究表明细胞骨架系统对微重力环境非常敏感,细胞骨架微管和微丝重排可能参与微重力导致的细胞形态及功能变化过程。近年来,NO在骨质疏松发展过程中作为信息分子的生理作用也已被人们重视。已经达成共识的是,成骨细胞的增殖及其骨基质蛋白分泌的功能依赖于少量NO的存在,而高浓度的NO既抑制成骨细胞的增殖和分化,还显著抑制成骨细胞碱性磷酸酶的活性和抑制成骨细胞合成骨钙素等骨基质蛋白。而NO是由NOS(nitric oxide synthase, NOS)以L-精氨酸为底物合成的,NOS作为一种局部信号分子,不同亚型的NOS所生成的不同浓度的NO对成骨细胞具有完全不同的生理意义。已有研究表明,微重力可促使NO/NOS系统发生一系列改变,如NO浓度增多等。本实验在前人研究的基础上,通过模拟微重力诱导微丝改变后,检测出成骨细胞NO/NOS系统的改变及成骨细胞标志产物(碱性磷酸酶和骨钙素)的变化,由此探讨失重导致骨质疏松的机制,是否是微重力诱导微丝改变影响NO/NOS信号系统进而导致基因表达发生改变而影响细胞的分化过程。目的本研究主要从细胞水平探讨失重导致骨丢失的机制。通过对成骨细胞骨架微丝的观察及NO/NOS系统和成骨细胞标志产物的检测,得出它们之间的关联性,以期为失重性骨质疏松的机制研究提供新的线索。对象和方法1.细胞株及其培养本实验所用的小鼠成骨细胞株MC3T3-E1是由南方医科大学解剖教研室提供。实验时均采用同一批冻存细胞复苏后的第三代细胞,以保证细胞性状的稳定性。细胞用含10%胎牛血清(FBS)和双抗的低糖DMEM培养,2天换液,4天传代。2.成骨细胞株活性鉴定：采用茜素红矿化结节染色法检测体外矿化能力。3.建立模拟微重力成骨细胞模型、分组干预：实验分为正常重力组、模拟微重力组、模拟微重力+0.5μg/ml细胞松弛素B组、0.5μg/ml细胞松弛素B组。4.细胞染色：用FITC标记的phalloidin对细胞骨架微丝进行染色,用DAPI对细胞核进行染色。5.ALP活性测定：对硝基苯酚法测定各组细胞培养液中的ALP活性。6.OCN表达量测定：运用ELISA测定各组细胞培养液中OCN的表达量。7.NO含量测定：用硝酸还原酶法检测各组细胞培养液中NO的浓度。8.NOS活性测定：使用NOS分型试剂盒测定细胞裂解液中NOS的酶活性。结果1.成骨细胞生长情况：MC3T3-E1细胞株经复苏培养后,在相差显微镜下呈三角形、菱形、多边形等不规则形状,透明度好。细胞有触突,胞浆丰富并向外伸展,伸出几个突起与临近细胞伸出的突起相连,有聚集成团(集落)的现象。胞核大而清楚,呈圆形或卵圆形,含1～2个核仁2.体外矿化能力检测：末次传代的细胞生长至2周后细胞呈复层状生长,中心部细胞密集可发生钙化,形成肉眼可见的散在白色点状物。茜素红法矿化结节染色后,钙盐沉积区域呈红色。3.细胞微丝骨架的改变：采用微丝荧光标记技术同时检测4组细胞微丝骨架结构的变化。细胞在旋转培养及松弛素B处理后均出现微丝结构改变,结果表明细胞骨架对微重力及松弛素都非常敏感。MC3T3-E1细胞在经过回转模拟微重力培养后,细胞微丝骨架出现局部解聚和张力纤维减少的趋势,张力纤维短而纤细,散乱分布于胞浆内、无方向性；0.5μg/ml细胞松弛素B处理的对照组微丝解聚的程度和模拟微重力组差不多,微丝结构也粗细不一、方向多变；模拟微重力+0.5μg/ml细胞松弛素B培养组的改变则更明显,微丝明显解聚、骨架蛋白弥散分布、细胞骨架的网络结构消失、细胞核区不可分辨；而正常重力培养的对照组,细胞的微丝骨架排列有序、粗细均匀、走向清晰。4.各组ALP活性：MC3T3-E1细胞在正常重力组中分泌的ALP的活性最高,为6.2867±0.3980金氏单位/100ml,和其余3组的差异均有统计学意义(P<0.05)。模拟微重力+0.5μg/ml细胞松弛素B组的ALP活性为2.9333±0.7805金氏单位/100ml,较模拟微重力组稍低,差异有统计学意义(P(0.05)。而模拟微重力组和0.5μg/ml细胞松弛素B组的ALP活性分别为4.8900±0.6802金氏单位/100ml和5.6933±0.1266金氏单位/100ml,两组相比较无统计学意义(P>0.05)。5.各组OCN表达量ELISA结果：模拟微重力组MC3T3-E1细胞表达的OCN的量为2.70816±0.53271pg/ml,居于正常重力组和模拟微重力+0.5μg/ml细胞松弛素B组之间,3组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。正常重力组细胞OCN的表达量最高,为14.23681±2.85252pg/ml,模拟微重力+0.5μg/ml细胞松弛素B组最低,为1.50685±0.40666 pg/ml。0.5μg/ml细胞松弛素B组OCN的表达量为3.84456±1.23788pg/ml,和模拟微重力组相比较无统计学意义(P>0.05),这和碱性磷酸酶的结果相统-6.各组iNOS酶活性：模拟微重力组iNOS的酶活性为16.6043±1.3292U/ml,高于正常重力组,其值为5.8183±0.3196 U/ml,而低于模拟微重力+0.5μg/ml细胞松弛素B组,为19.6990±0.5582 U/ml,且差异均有统计学意义(P<0.05)。0.5μg/ml细胞松弛素B组iNOS的酶活性为15.3760±2.8211U/ml,和模拟微重力组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。7.各组eNOS酶活性：正常重力组eNOS的酶活性最高,为7.1510±0.6780 U/ml,和其余3组的差异均有统计学意义(P<0.05)。模拟微重力+0.5μg/ml细胞松弛素B组eNOS的酶活性为1.0987±0.4776 U/ml,较模拟微重力组稍低,差异有统计学意义(P<0.05)。而模拟微重力组和0.5μg/ml细胞松弛素B组eNOS的酶活性分别为2.3613±0.2946 U/ml和2.4633±0.4603 U/ml,两组相比较无统计学意义(P>0.05)。8.各组NO浓度：实验组及对照组MC3T3-E1细胞的培养液中均能检测到NO的表达。模拟微重力组NO的浓度为109.2593±4.8996μmol/L,明显高于正常重力组81.4813±2.4494μmol/L,但低于模拟微重力+0.5 u g/ml细胞松弛素B组129.9383±9.9865μmol/L,差异均有统计学意义(P<0.5)。而0.5μg/ml细胞松弛素B组NO的浓度为100.0003±8.0721μmol/L,和模拟微重力组比较无统计学意义(P>0.05)。结论1.MC3T3-E1成骨细胞株具有和原代培养大鼠成骨细胞相同的生物学特性。2.微重力具有和细胞松弛素B相似的作用——破坏成骨细胞骨架微丝结构。3.随着成骨细胞骨架微丝解聚程度的加深,成骨细胞活性减低更明显,使碱性磷酸酶活性及骨钙蛋白表达量下降更显著。4.成骨细胞骨架微丝的改变可以进一步调控NO/NOS信号系统。