自古以来,桑叶是家蚕的主要食物来源,却不是蓖麻蚕的天然宿主,其乳汁中富含的防御蛋白MLX56和1-脱氧野尻霉素(DNJ)等生物碱却对蓖麻蚕和甘蓝夜蛾等食草性昆虫有致命毒性,而家蚕对桑乳汁的毒性存在独特的适应性机制。蓖麻蚕已被利用于发现和评估植物对食草昆虫的防御应答,因此我们选择蓖麻蚕作为实验昆虫,来评估短期添食DNJ对非食桑昆虫的毒理及作用分析。1-DNJ是一种天然的D-葡萄糖类似物,在生物体内有很强的生理活性。它能抑制小肠和肝脏内的α-葡萄糖甘酶,延迟血管的衰老和削弱胆固醇代谢。基于DNJ的潜在药用价值,富含DNJ的天然产物可以作用口服治疗糖尿病的药物,在许多国家的市场上已经出现了各种含有DNJ成分的药品。以往的研究往往着重于DNJ在小鼠或者其他哺乳动物上的抗糖尿病作用,而鲜有DNJ作用于昆虫,随之引起的具体的生理机制改变和毒性反应等方面的报道。核磁共振(NMR)能对样品实现无破坏性、无选择性和无偏向的分析,实验方法灵活多样,可在接近生理条件下进行实验。基于NMR的代谢组学分析方法作为当前代谢组学研究中的主要技术之一,比较适合病理研究和药物作用后改善机制研究,也很适合研究代谢产物中的复杂成分。本研究中运用代谢组学技术研究DNJ作用于蓖麻蚕体内的代谢调控机制,有助于从整体上阐明DNJ引起糖代谢、能量代谢等通路变化的生理机制。同时结合转录组技术及RT-qPCR验证,鉴定蓖麻蚕糖代谢和能量代谢相关的酶以及代谢途径,结合代谢组学数据,分析蓖麻蚕添食DNJ后,催化糖代谢和能量代谢的关键酶基因的差异表达情况。主要结果如下:1.DNJ对蓖麻蚕的毒理分析:4龄起蓖麻蚕添食5μl的H2O、0.25%DNJ、0.5%DNJ、乳汁和混合物(0.5%DNJ与乳汁1:1混合),每天一次,连续喂食2天,在第3天只有乳汁组发生了蓖麻蚕的死亡,死亡率高达40%。为了进一步验证DNJ对蓖麻蚕的毒性,取5龄起蓖麻蚕分别添食5μl的H2O、1%和2%DNJ,每天一次持续3天,无蓖麻蚕死亡。实验结果说明:短期添食0.25-2%DNJ对蓖麻蚕无明显的毒理反应,乳汁中的UHMWs和防御蛋白MLX56很可能是使蓖麻蚕致死的主要因素,且有浓度依赖性。2.基于NMR的代谢组学技术,分析DNJ引起蓖麻蚕的血淋巴、中肠和脂肪体组织内的糖代谢及能量代谢途径的变化。我们把得到的数据进行模式识别及代谢物定量分析,结果显示不同浓度的DNJ均可引起蓖麻蚕的血淋巴、中肠和脂肪体组织的显著代谢轮廓差异。定量分析得知,添食DNJ后,血淋巴中海藻糖、乳酸和丙氨酸浓度上调,琥珀酸、柠檬酸、苹果酸和延胡索酸这些TCA循环的中间产物浓度降低,意味着海藻糖水解、糖异生和TCA循环水平降低,糖酵解途径增强,同时参与其中的催化酶活性改变;中肠和脂肪体中海藻糖水解和TCA循环途径受抑制。3.以转录组技术分析5龄起蓖麻蚕添食DNJ和对照添水组后,获得了蓖麻蚕转录组的基本信息,发现添食DNJ后蓖麻蚕体内表达显著上调的unigenes有577条,下调表达的unigenes有288条。进一步分析添食2%DNJ后催化糖代谢和能量代谢的关键酶基因的差异表达情况,结果显示,添食DNJ后活性很可能改变的琥珀酸脱氢酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶和海藻糖酶的25条unigenes表达无差异。活性受抑制的葡萄糖苷酶的5条相关unigenes表达上升。4.根据转录组数据,我们获得了蓖麻蚕糖代谢和能量代谢相关酶基因的信息。本文采用相对定量PCR的方法,测定蓖麻蚕血淋巴内海藻糖酶和葡萄糖苷酶基因的mRNA表达。2条海藻糖酶基因:trehalase-1B和trehalase-2在蓖麻蚕添食1%和2%DNJ后6-48h,表达与对照组无差异。3条葡萄糖苷酶基因中α-glucosidase基因在蓖麻蚕添食2%DNJ后12h显著上调,glucosidaseⅡβsubunit基因在蓖麻蚕添食2%DNJ后6-12h表达升高,uncharacterized family 31glucosidase基因在不同时间点的实验组和对照组之间表达无差异。实验结果与转录组的基因差异表达分析基本相符。综上,本文获得了添食DNJ后,对蓖麻蚕体内糖代谢和能量代谢等途径的影响,及参与其中的关键酶的转录水平差异结果,为进一步研究DNJ的药物靶点和具体作用机制提供了参考。