论文部分内容阅读
目的云南藤黄是我国特有的藤黄属植物,前期研究证明云南藤黄提取物具有较好的抗肿瘤和抗菌活性,有潜在的开发价值。本文拟采用LC-MS导向分离的策略,对云南藤黄的化学成分进行较为系统的研究,并对发现的化合物进行抗肿瘤和抗菌活性评价,阐明云南藤黄的药效物质基础并寻找结构新颖且活性显著的成分,为其进一步开发奠定基础。方法1.建立LC-MS分析方法,对云南藤黄提取物及其分离组分进行分析,筛选可能的新化合物,通过硅胶、ODS、MCI以及制备液相等色谱手段对筛选的成分进行针对性的分离。利用MS、NMR、ECD计算和X-ray单晶衍射技术等技术对化合物的结构和绝对构型进行解析。2.使用UPLC-ESI-QTOF-MS/MS对所得化合物进行分析,研究不同亚型PPAPs类化合物的质谱裂解规律。3.使用CCK-8法筛选PPAP亚胺类成分1-5及其对应的5个PPAPs类底物的细胞毒活性。4.使用微量肉汤稀释法筛选化合物的抑制金黄色葡萄球菌活性;对于没有抑菌活性的化合物,使用免疫印迹法,筛选它们抑制金葡菌α-溶血素（Hla）的作用。结果1.共得到了20个新化合物,其中garciyunnanimines A-C（1-3）和garciyunnanins C-Q（6-20）是从云南藤黄中分离鉴定的,化合物garciyunnanimines D和E（4和5）是以oblongifolins A和B为底物通过仿生合成的方法转化得到的。按照化合物结构的类型,可以分为B型PPAPs类成分及衍生物（1-16）、xanthones类成分（17）、具有1-氧杂螺[4.4]壬烷母核的螺环衍生物（18和19）和环肽类成分（20）四类。其中B型PPAPs类成分及衍生物（1-16）,按照亚结构的不同,可以分为个五个亚型:a.化合物13-16为典型的B型PPAPs类化合物,其中化合物14是首个来源于天然植物的C-2与C-12通过氧相连接,形成吡喃酮环的PPAPs类化合物;b.化合物1-5为首类结构中含有氮元素的PPAPs类成分,命名为PPAP亚胺类成分,该类成分与对应B型PPAPs类化合物的区别为其C-10位被亚胺基团取代。通过席夫碱反应,确定了PPAP亚胺类成分的结构以及两类成分之间的生源关系,并建立了以PPAPs类成分为底物转化为PPAP亚胺类成分的仿生合成方法;c.化合物6-9属于具有罕见的[3.4.1]-十一烷母核骨架的B型PPAPs类化合物;d.化合物10为具有二环壬烷母核的PPAPs类衍生物;e.化合物11和12是具有6/6/6/6四元环系的PPAPs类衍生物。2.发现化合物guttiferone F和30-epi-cambogin中C-30手性碳的绝对构型存在问题,利用核磁和X-ray衍射技术重新确认C-30手性碳的绝对构型,将guttiferone F和30-epi-cambogin的结构修正为garcinol和cambogin。3.发现PPAP亚胺类成分与B型PPAPs类成分具有不同的裂解特征。正离子模式下,PPAP亚胺类成分具有m/z 286.0715和m/z 176.0348的特征碎片,可以作为该类成分的诊断离子,对这类成分进行筛选和表征;负离子模式下,PPAP亚胺类成分的主要裂解特征为C-10-C-11键断裂,脱去芳环。4.修正了前期研究报道中B型PPAPs类成分在正、负离子具有相同裂解特征的结果,发现B型PPAPs类成分在正、负离子模式下具有不同的裂解特征。正离子模式下,B型PPAPs类成分根据结构的不同,化合物具有m/z 177.0182和（或）m/z 165.0182的特征碎片,与课题组前期研究结果一致。负离子模式下,B型PPAPs类成分的主要质谱裂解特征为C-2-C-3键、C-4-C-5键断裂,根据化合物中酰基取代基的不同,形成不同的特征碎片。5.体外细胞毒实验显示5个PPAPs亚胺类成分均具有较好的细胞毒活性,抑制A549和RPMI-8226肿瘤细胞的IC50均在10μM以下。初步构效关系研究显示,C-10被亚胺基团取代的PPAP亚胺类成分细胞毒活性优于其对应的PPAPs类底物。6.体外抑菌实验结果显示,化合物16抑菌活性最好,MIC值为3μg/m L。对无抑菌作用的化合物进行了抑制金葡菌Hla作用筛选,结果说明化合物6和7在25μM时可以显著抑制金葡菌Hla的表达,而且不影响细菌的正常生长。结论本研究共得到了20个新化合物,其中16个为B型PPAPs类成分及衍生物,可分为5个亚型。这些化合物的发现,丰富了PPAPs类化合物的类型,深化了对云南藤黄化学成分的认识。通过对多种亚型的B型PPAPs类成分及衍生物的质谱裂解特征进行研究,修正、完善了B型PPAPs类成分的质谱特征研究,提高了利用质谱表征不同PPAPs类成分的能力。体外活性研究结果显示化合物1-5具有良好的细胞毒活性;化合物16具有抑制金葡菌生长的作用;化合物6和7能够降低金葡菌Hla的蛋白表达。本研究的开展,为全面认识云南藤黄的物质基础奠定了基础。