大肠癌是常见肿瘤,全球发病率居第三位。在我国,大肠癌死亡率目前位列第五位,但发病率增长迅速。大肠癌的首选治疗方案为手术切除,但根治性切除后病人的5年生存率只有50%左右。另外,由于临床上对大肠癌早期诊断困难,相当部分的病人确诊时已属晚期,不适宜手术,加上术后复发,大部分病人主要靠内科治疗。这部分病人预后很差,其中位生存时间仅6-9月。大肠癌对目前常规化疗不敏感,常用化疗药物是5-氟尿嘧啶(fluorouracil,5-Fu),5-Fu五十年来一直是胃肠道癌的首选药物,也是其联合化疗的基础药。但5-Fu作为大肠癌辅助化疗药物,其单药有效率不高。据临床报道其对大肠癌的有效率为8%-85%。Byuse等报道4700例对比5-Fu化疗与单纯手术的Ⅲ期临床研究,5-Fu化疗组5年生存率有2.3%～5.7%的优势,但无统计学意义。近年来,新的、有效的化疗药物不断出现,新药伊利替康(CPT211)、草酸铂、raltitrexal以及分子靶向药物西妥昔单抗(cetuximab)等在治疗晚期大肠癌中有一定疗效,但仍然存在着治疗效果不理想、价格昂贵和毒副反应大等缺点,并且不能肯定提高大肠癌病人的远期生存率。因此,抗肿瘤新药的开发研制仍是当务之急。中医药中蕴藏着极其丰富的抗癌药物,中药具有多靶点、多效应、毒副作用小、不易产生耐药性、安全有效等优点,另外从化学合成药物寻找抗癌药物的难度远远超过从传统中药寻找新药,因此寻找抗癌中药以及中药有效成分成为当前抗肿瘤药物研究的热点。本研究选择TP (Triptolide, TP, Accession No of PubChem Substance:SID:685302),是中药雷公藤(Tripterygium wilfordii)的一种重要活性成分。雷公藤是中药中对重大难治性疾病具有突出而稳定疗效的少有药物之一,其有效治疗病种集中于以类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、慢性肾炎等为代表的自身免疫病,对于这类疾病,除其疗效可与世界同类疾病治疗的化学药物相媲美外,以细胞因子拮抗、免疫调节、抗炎镇痛及活血化瘀等为作用特点的疗效机理,更使其日益彰显出作为一种新类型药物的价值。在药学领域,一种能同时针对自身免疫病这样的复杂难治性疾病发病过程与机理紧密相关的多靶点、且与该类疾病治疗策略紧密相符的药物是不多见的。TP是中药雷公藤的一种重要活性成分,TP能够抑制激活的单核细胞和精母细胞的增殖,因而具有抗炎和抗生育作用,长期被用来治疗炎症。近来很多报道表明TP也能够抑制体外肿瘤细胞的增殖和体内肿瘤的生长,如Shamon等发现TP能够抑制人乳腺癌细胞在裸鼠体内的生长增殖, Tengchaisri等也报道TP可以抑制仓鼠的胆管癌细胞生长。另外,我国临床试验表明TP治疗单核细胞性白血病和粒细胞性白血病分别能够获得71%和87%的缓解率,疗效远远高于目前所能够获得的其它化疗药物。在美国,TP已进入一期临床试验。相关研究表明,CRC细胞也受到TP抑制。TP的抗癌作用比较明确,但其作用机制目前尚不清楚,尽管已有一些研究对TP抗肿瘤的可能机制进行了探讨。一些结果表明：TP可诱导细胞凋亡,p53为野生型细胞的p53激活起到非常重要的作用。TP抑制肿瘤细胞生长的其它分子机制还可能还包括：TP可抑制]NF-κB。细胞外调节蛋白激酶2(extracellμlar regμlated protein kinases2, ERK2的),这是一个有丝分裂原激活蛋白激酶家族成员,在肺癌细胞中受到Apo2L/TRAIL和PG490联合治疗而被激活。热休克蛋白70(Heat shock protein70, HSP70)受到TP抑制。TP治疗的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)细胞,XIAP蛋白水平在凋亡蛋白酶作用下显着降低。TP治疗的慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)细胞,Bcr-Abl下调。RNA聚合酶活性受到TP抑制,间接地影响了转录机制,导致短寿的mRNA的迅速减少,包括转录因子,细胞周期调控因子(CDC25A),和原癌基因(MYC和Src)。然而,TP抑制肿瘤生长的机制仍旧处于起步阶段,详细作用机制仍需深入探讨。其中,TP抑制大肠癌细胞机制更不清楚。本研究对TP抑制大肠癌细胞作用进行验证,并利用蛋白质组学方法比较大肠癌细胞受到TP刺激后发生上调或下调的蛋白质,这将有利于揭示TP抑制CRC生长的作用机制,将有助于为其临床应用提供理论基础,并有利于理解CRC发生发展机制,为其临床治疗提供候选靶点。本课题采用的具体研究方案如下：1)建立稳定表达绿色荧光蛋白的大肠癌细胞株SW480-EGFP。构建真核表达的携带增强型绿色荧光蛋白的质粒载体,转染至SW480细胞,用G418进行筛选,得到SW480-EGFP。2)TP对SW480细胞生长增殖的影响及细胞是否发生凋亡的检测。利用MTT法检测不同浓度TP刺激SW480后48h细胞的生长增殖抑制情况。利用Annexin V-FITC/PI双标记法检测TP对SW480细胞早期凋亡的影响；利用琼脂糖凝胶电泳观察凋亡DNA LADDER现象的产生。用流式细胞技术检测TP作用SW480不同时间点对细胞周期的影响。3)建立荷SW480-EGFP大肠癌裸鼠移植瘤模型。首先用细胞悬液接种法获得SW480-EGFP细胞形成的瘤块,然后采用瘤块包埋法获得裸鼠皮下移植瘤。4)在体验证TP对大肠癌瘤块生长的抑制作用。上述大肠癌模型建立后,将裸鼠随机分为2组：一组按0.15ng/kg/日腹腔注射TP,每日一次；另一组为对照。实时观察肿瘤生长情况。5)利用蛋白质双向凝胶电泳技术(2-DE)筛选TP作用于SW480后不同时间点表达、修饰发生变化的蛋白质。利用western-blot技术、免疫荧光技术在细胞水平验证筛选到的蛋白的表达、修饰变化。6)验证筛选得到的蛋白质的功能利用基因克隆技术构建携带该蛋白编码基因的真核表达质粒,将该质粒转染至SW480细胞,另外用RNA干扰技术将使该蛋白的基因表达沉默,比较不同情况下细胞的生长、增殖、转移情况及对药物的反应,探讨其在肿瘤发生发展中的作用。我们首先验证了TP体内及体外抑制大肠癌增殖的作用。结果表明：1.SW480细胞和Lovo细胞经过不同浓度TP处理后进行MTT检验,发现相对于对照组,两种细胞光密度值均下降,而TP处理后,SW480细胞生长受到抑制更加显著。2. DNA ladder实验、流式细胞术进行细胞凋亡情况检测表明,高浓度TP刺激的SW480细胞与对照组细胞凋亡水平没有显著差异,说明TP不会引起细胞凋亡。3.SW480细胞受到TP刺激后,利用流式细胞术进行细胞周期检测,相对于对照组,TP刺激24h,细胞周期无明显变化；而TP刺激48h,处于S期细胞数明显增多,具有显著的统计学差异。因此,TP能够使SW480细胞生长周期显著阻滞在S期。4.裸鼠大肠癌异位移植瘤模型制备成功后,给予腹腔注射TP,每5日进行瘤块大小监测,我们发现,与对照组相比,从第15日开始,TP治疗组裸鼠瘤块的生长速度即明显慢于对照组。因此,TP能显著抑制细胞增殖。然后,我们用基于2-DE的蛋白质组学方法探讨了TP抗大肠癌细胞增殖的可能机制。我们通过比较四组细胞(DMSO24h(A组),DMSO48h(B组),TP20nM24h (C组),TP20nM48h(D组))蛋白质双向凝胶电泳银染图谱,发现有5个蛋白质点同时满足以下四个条件：1)C组与A组之间存在差异；2)D组与B组之间存在差异；3)D组与B组存在差异；4)变化趋势1.5倍以上。经过生物信息学分析以及文献检索,发现T2、T3、T4都属于同一个家族,分别是14-3-3protein beta/alpha、14-3-3protein epsilon、14-3-3protein theta。哺乳动物的14-3-3是一个高度保守的酸性蛋白质家族,由7个亚型组成。14-3-3蛋白能够以phosphorserine/phosphothreonine依赖方式与其它蛋白质相互作用,在细胞周期调控,细胞生长,分化,存活,凋亡,迁移和扩散等过程中发挥关键作用。除了其众所周知的促增殖和抗凋亡作用以外,研究发现14-3-3蛋白也能够抑制胞生长和细胞周期的进程,尤其是DNA损伤后。已经发现一些机制参与肿瘤抑制功能,包括调控胞质分裂(cytokinesis)以及Hippo信号通路、P-catenin信号通路。14-3-3蛋白质家族中,肿瘤抑制活性的研究最清楚的是14-3-3σ。在我们鉴定的几个14-3-3蛋白质家族成员中,有报道表明14-3-3ε和肿瘤细胞周期抑制、细胞凋亡相关。还有一些研究结果提示,TP和14-3-3ε之间存在某种联系。Matsui等发现TP需要通过多个环节信号分子激活或者重要分子的细胞内转运来调节PKC-GSK3p信号通路,进而抑制p53的转录活性。Protein kinase C (PKC)-α对胰岛素活性具有调节作用。Oriente等表明PKC-α可以直接与IRS-1、14-3-3ε结合。在过表达胰岛素受体(3T3-hIR)的NIH-3T3细胞,胰岛素选择性地增加PKC-a和IRS-1、14-3-3s的共沉淀,但不与IRS-2及其他14-3-3亚型共沉淀。3T3-hIR细胞过表达14-3-3ε时,能显着降低IRS-1结合的PKC-α活性,但并不影响IRS-1/PKC-α共沉淀。14-3-3ε过表达也能够增加胰岛素刺激引起的的胰岛素受体和IRS-1酪氨酸磷酸化,进而使Raf1、ERK1/2的、Akt/protein kinaseB活性增强。胰岛素引起糖原合酶活性和胸腺嘧啶合成也增加。选择性地抑制14-3-3ε会导致IRS-1结合的PKC-α活性增加3倍,以及相当程度的胰岛素受体和IRS-1酪氨酸磷酸化介导的信号通路活性降低。反过来,选择性地抑制]KC-α表达能够逆转14-3-3ε表达减少对胰岛素信号通路的影响。另一方面,14-3-3ε磷酸化后能够与p53相互作用并对p53进行调控。而如前所述,p53基因在TP诱导的细胞生长抑制过程中起着关键作用。上述研究提示了14-3-3ε和雷公藤加速之间可能存在某种联系,并引起癌细胞生长抑制,这在本研究中得到了证实。目前得到阐明的14-3-3家族蛋白通常的作用方式是14-3-3将其相互作用蛋白质转运到细胞内的另一个部分(一般是细胞质),从而使与其相互作用的蛋白功能丧失。这种14-3-3-配体复合物在细胞质定位,最早认为是由14-3-3蛋白羧基端的出核序列(NES)介导的。但后来的结果表明,14-3-3羧基端的α-螺旋并不发挥NES作用,但却与其配体蛋白的相互作用至关重要。因此,14-3-3蛋白似乎充当“分子司机”角色,运输配体到细胞内的某个特定部位,这个过程决定于配体蛋白与14-3-3蛋白结合后,其特异性定位序列被被暴露出来。例如,14-3-3ε磷酸化诱导其与促凋亡转录因子FKHRL1结合,导致FKHRL1的2个NES结构暴露出来。进而,FKHRL1被运送到细胞质而失去活性。另外,14-3-3的结合能够覆盖FKHRL1的入核序列,从而阻断FKHRL1重新入核。在有丝分裂的间期,14-3-3ε与Cdc25C结合后,将Cdc25C转移并限制在细胞质中,从而阻断cdc2的激活。Li等人发现14-3-38、Cby、β-catenin形成了一个稳定的复合体,能够促进β-catenin出核。因此14-3-3ε通过与Cby联合抑制β-catenin信号通路而发挥抑制肿瘤增殖功能。在本研究中,免疫荧光法用来检测14-3-3ε表达和亚细胞定位。结果表明,TP处理后48小时,14-3-3ε明显移位到细胞质中。这些结果表明,14-3-3ε易位介导了TP引起的细胞S期捕获。我们进一步用RT-PCR检测TP处理或不处理时SW480细胞14-3-3ε表达情况。结果表明14-3-3ε表达没有发生改变。转染14-3-3ε使其在SW480细胞过表达。然后,检测了14-3-3ε过表达对SW480细胞增殖的影响,发现细胞增殖略有增强,这与先前的研究相一致。这些结果提示,TP诱导的细胞增殖抑制不是由14-3-3ε表达改变引起的。对蛋白质双向电泳图谱的进一步分析显示,TP处理后,并非完整的14-3-3ε发生上调,而是其剪切体形式增加,这与Kuzelova等人报道相同。质谱分析获得的肽段也只覆盖了14-3-3ε氨基末端。本研究的体内和体外Western-blot实验都表明雷公藤处理细胞后剪切体形式14-3-3ε增加。已有报道剪切体形式的14-3-3ε蛋白参与细胞凋亡,Won等发现14-3-3ε是caspase-3的底物之一。当培养的哺乳动物细胞被诱导凋亡时,14-3-3ε被剪切了。14-3-3ε蛋白的Asp238是caspase-3的作用位点。他们认为,凋亡过程中14-3-3ε蛋白的剪切释放Bad并使其移位到线粒体与Bcl-x(L)相结合,从而促进了细胞死亡。Kuzelova等表明14-3-3ε蛋白的裂解至少由两种不同的机制介导,可能涉及caspase-3和caspase家族以外的蛋白酶。结论综上所述,我们认为,SW480细胞在受到TP处理后,14-3-3ε蛋白的剪切及向细胞质移位在抑制CRC生长过程中发挥关键作用。