前言亚临床甲状腺功能减退症(Subclinical hypothyroidism,SCH)又称亚临床甲减,在一般人群的总体患病率是4-10%,妊娠期妇女患病率为5%。母体甲减,特别是碘缺乏病引起的母体和胎儿甲减可以导致儿童的智力缺陷(克汀病)早已被认识。Man及其同事首次发现轻微的母亲甲减就可引起后代智力评分(intelligence quotient,IQ)降低,1999年Haddow和Pop等学者发现：母亲妊娠时TSH升高或FT4降低会导致后代智力评分降低,本课题组的研究结果也提示妊娠16～20周妇女单纯亚临床甲减,单纯低T4血症和单纯TPOAb阳性皆可以使后代25-30月时的智力和运动发育评分降低8-10分。但是母亲亚临床甲减引起后代智力评分降低的确切机制还不清楚,本研究拟通过动物实验探讨左旋甲状腺素(L-T4)治疗孕期母鼠亚临床甲减改善仔鼠脑发育的有效性及治疗的最佳时期,并探讨其作用机制。方法75只Wistar雌鼠称重并麻醉后行甲状腺完全切除术,一个月后眶后静脉采血检测甲功,当血清TSH高于正常,但TT4小于最小值(<1μg/dL)时,提示甲状腺切除干净,成功建立临床甲减(CH)模型。其中15只临床甲减鼠皮下注射含有BSA的PBS液；60只以0.95μg/100g·d剂量皮下注射L-T4,9天后眶后静脉采血检测甲功,当血清TSH高于正常、而TT4水平在正常范围时,提示亚临床甲减大鼠(SCH)模型建立成功。另15只Wistar雌鼠行甲状腺切除假手术做为正常对照组(C),皮下注射含有BSA的PBS液。各组模型建立成功后同时与正常雄鼠合笼交配,雌：雄=2：1,当次日晨发现雌鼠阴道栓或阴道涂片镜下发现精子确定为妊娠0天,记为E0。60只亚临床甲减孕鼠模型,其中15只孕鼠继续以0.95μg/100g·d剂量皮下注射L-T4至产后21天(P21)；其余45只大鼠分别在妊娠第10天(E10)(n=15)、第13天(E13)(n=15)及第17天(E17)(n=15)开始以1.25μg/100g·d剂量皮下注射L-T4到P21；所有母鼠分别于孕前、E10、E13、E17、E19眶后静脉丛取血,测定血清TSH、TT4,在E14-E16天腹腔注射溴脱氧尿苷(BrdU)20mg/kg·d共3天。分娩当天记为P0。P3时每窝仔鼠择优存留8只,P3、P7及P40时监测仔鼠体重,对仔鼠脑发育相关的指标进行检测。P45应用水迷宫实验检测仔鼠学习记忆能力。Nissl染色法在光学显微镜下观察大脑皮质和海马形态学改变；应用免疫组化染色检测BrdU的分布,从而判断妊娠早期大脑皮质细胞的迁移位置；应用免疫组化或Western blot进行Reelin、肌腱蛋白-C、L1细胞粘附分子(LICAM)及层粘连蛋白的半定量分析。结果1、血清TSH、TT4水平结果显示与假手术组比较,亚临床甲减组表现为血清TSH水平明显高于同期假手术组(P<0.05),而TT4水平未见明显改变(P>0.05),符合亚临床甲减激素血清学改变。E10治疗组、E13治疗组及E17治疗组在治疗之前TSH升高(P<0.05),TT4无明显改变(P>0.05),仍处于亚临床甲减状态,治疗后孕鼠血清激素水平示TSH及TT4与正常对照组孕鼠均无明显区别(P>0.05)。2、发育期各组仔鼠的体重及激素水平比较P3及P7时亚临床甲减组仔鼠体重明显低于正常对照组仔鼠(P<0.05),P40时与正常对照组无明显区别(P>0.05)；与完全甲减组仔鼠相比,P3时高于完全甲减组(P<0.05),但P7及P40时无明显区别(P>0.05)；甲减组仔鼠体形偏小,体重增加缓慢,在P3、P7及P40时体重均低于正常对照组仔鼠(P<0.05)。E10治疗组、E13治疗组及E17治疗组仔鼠体重在P3、P7及P40与正常对照组仔鼠均无明显区别(P>0.05),明显高于完全甲减组。40日龄进行甲功测试时发现各组仔鼠血清TSH激素水平及血清TT4激素水平均无统计学差异(P>0.05)。3、Morris水迷宫行为测定指标分析甲减组及亚临床甲减组逃避潜伏期与对照组比较均有显著性差异(P<0.05),到第5天时逃避潜伏期与对照组比较仍有显著性差异(P<0.05)。E10治疗组仔鼠及E13治疗组仔鼠在各时段训练的逃避潜伏期与正常对照组仔鼠均无明显差别(P>0.05),但E17开始治疗组各时段训练的逃避潜伏期均比正常对照组仔鼠延长,差异显著(P<0.05)。4、各组仔鼠皮质及海马病理形态学变化Nissl染色光镜结果显示7日龄正常对照组仔鼠躯体感觉皮质各层神经细胞排列致密整齐,Ⅳ层见典型的桶状结构,Ⅴ层见大的锥体细胞,各细胞层间界限清晰,亚临床甲减组及完全甲减组仔鼠躯体感觉皮质则无这些典型的表现。E17治疗组也是如此,但E10开始治疗及E13开始治疗组仔鼠表现与正常对照组仔鼠无明显差别；40日龄仔鼠也有类似结果。皮质厚度测量结果显示P7时各组仔鼠之间均无明显差别(P>0.05),P40时甲减组仔鼠皮质比正常对照组仔鼠薄(P=0.000)。正常对照组仔鼠海马CA1区锥体细胞层界限清晰,E10治疗组及E13治疗组仔鼠表现与正常对照组仔鼠无明显差别,E17治疗组、亚临床甲减组及完全甲减组仔鼠海马CA1区神经元层间界限不清。亚临床甲减组及完全甲减组仔鼠海马锥体层(py)增厚,辐射层(ra)较薄(P<0.05),E17治疗组与之类似,但E10治疗组及E13治疗则与正常对照组相似,厚度无统计学差异(P>0.05)。5、大脑细胞迁移情况亚临床甲减组及临床甲减组仔鼠BrdU标记的细胞分布更广泛,白质内出现BrdU标记的细胞,统计结果显示Ⅵ层及皮质下白质内BrdU标记细胞的数量明显多于正常对照组仔鼠,Ⅱ-Ⅲ层减少(P<0.05),神经细胞移行于与出生日期不相应的异常位置；E17治疗组仔鼠表现与亚临床甲减组及完全甲减组仔鼠相似,但E10治疗组及E13治疗组则与正常对照组仔鼠相似(P>0.05)。6、各组仔鼠大脑Reelin及肌腱蛋白-C表达量的变化免疫组化染色发现：7日龄及40日龄甲减组、亚临床甲减组及E17治疗组仔鼠躯体感觉皮质及海马Reelin的表达量明显低于正常对照组(P<0.05),E10及E13治疗组与正常对照组无明显区别。7日龄甲减组、亚临床甲减组及E17治疗组仔鼠躯体感觉皮质肌腱蛋白-C表达量明显高于正常对照组(P<0.05)；40日龄各组之间均无明显区别。7、仔鼠皮质和海马组织的L1CAM、层粘连蛋白(Laminin)水平Western blotting检测皮质结果显示,与正常对照组比较,E17治疗组、亚临床甲减组及甲减组仔鼠皮质L1CAM三个主要多肽的蛋白表达量在出生后3d(P3)明显升高(P<0.05),但E10及E13治疗组则与正常对照组无区别；P7时甲减组L1CAM 140kDa多肽的表达明显多于正常对照组(P<0.05),其他各组间无差异；P40时L1CAM的三个主要多肽在各组间均无明显差异。海马检测结果显示,与正常对照组比较,甲减组仔鼠皮质L1CAM三个多肽蛋白表达量在出生后3d(P3)明显升高,E10、E13、E17及亚临床甲减组L1CAM三个多肽与正常对照组之间均无明显区别(P>0.05)；P7及P40时海马L1CAM的三个主要多肽在各组间的表达均无明显差异。皮质及海马检测结果显示层粘连蛋白在各组之间均无明显区别(P>0.05)。结论1、孕期母鼠亚临床甲减会影响后代的正常发育,孕第10天(E10)、E13和E17开始应用L-T4治疗母鼠至甲功正常,都可以促进仔鼠体重的正常发育。2、母体甲减及亚临床甲减可以导致后代学习记忆能力的严重损伤,若在E13之前进行L-T4治疗则对后代仔鼠行为学测定指标无明显影响；若在E17之后开始L-T4治疗则仍会对后代仔鼠行为学测定指标产生影响。3、亚临床甲减母鼠的后代学习和记忆能力的下降可能与细胞构筑、神经细胞的迁移及定位异常有关,E13之前开始L-T4治疗能够阻止神经细胞迁移及定位紊乱。4、甲状腺功能不足时细胞构筑、神经细胞迁移及定位的异常与迁移相关分子Reelin的下降、肌腱蛋白-C的上升及L1CAM的上升有关,而与层粘连蛋白无关。