目的:应用灌洗液酶联免疫斑点检测技术进行活动性肺结核临床诊断研究,以提升临床中活动性肺结核患者的临床诊断能力。方法:2017年8月到2018年8月深圳市第三人民医院肺科收治的疑似结核或待排除结核患者共414例,收集受试者临床基本信息,包括姓名、联系方式、既往病史、病情经过、合并症、影像学诊断、细菌学结果、病理学结果,并留取患者5ml外周血标本和配对的30 ml肺泡灌洗液标本,随后进行肺泡灌洗液单核细胞酶联免疫斑点检测技术（Bronchoalveolar lavage fluid mononuclear cell enzyme-linked immunospot assay,BALMC-Elispot）并评估其在活动性肺结核患者的临床诊断能力,同时进行外周血单核细胞酶联免疫斑点检测技术（Peripheral blood mononuclear cell enzyme-linked immunospot assay,PBMC-ELISPOT）、灌洗液抗酸染色涂片检测（BALF-acid fast bacilli,BALF-AFB）、灌洗液结核分枝杆菌培养（BALF-M.tuberculosis culture,BALF-M.tb culture）和灌洗液结核分枝杆菌基因扩增实验（BALF-nucleic acid amplification,BALF-Gene Xpert assay）作为对照;为了进一步证实肺泡灌洗液中存在丰富的结核分枝杆菌抗原特异性效应T细胞,我们从所有标本中随机选出29例外周血标本和11例灌洗液标本,通过密度梯度离心法分离出单个核细胞（PBMC/BALMC）,用抗CD4-PE-cy7和抗CD3-percp抗体进行表面染色,经4℃孵育30分钟后加入4%多聚甲醛固定30min,随后加入破膜剂进行破膜,10000rpm离心30s后加入抗IFN-γAPC-cy7抗体进行胞内染色,20分钟后样本在BD canto II仪器上读取,并使用流式软件进行分析。结果:成功构建肺泡灌洗液酶联免疫斑点检测技术新方法;与非肺结核相比,肺结核组肺泡灌洗液中抗原特异性伽马干扰素（interferon gamma,IFN-γ）的产生明显增加,差异有统计学意义;结核分枝杆菌两种特异性抗原-早期分泌抗原靶6000蛋白（Early Secretory Antigen Target 6000Protein,ESAT6）、早期分泌抗原靶6000蛋白/培养滤出液蛋白10的多肽（Peptides of Early Secretory Antigen Target 6000 Protein and culture filtrate protein 10,ESAT6/CFP10 peptide）不仅能够刺激机体产生免疫应答,且形成的斑点数量与标本类型相关;在痰培养阴性肺结核和痰培养阳性肺结核病人中,肺泡灌洗液中结核分枝杆菌特异性T淋巴细胞数远大于配对的外周血标本,此结果与流式染色结果一致;肺泡灌洗液中抗原特异性T细胞产生的斑点数与结核分枝杆菌的菌量密切相关,差异有统计学意义;与其他四种检测（包括BALF-M.tb culture、BALF-AFB、BALF-Gene Xpert、PBMC-Elispot）相比,BALMC-Elispot诊断结核病的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比分别是91.60%、81.50%、95.30%、70.20%、4.95、0.10,其敏感性远高于其他检查方法,阴性似然比远低于其他检测。BALMC-Elispot检测技术不受支气管结核以及糖尿病的影响,可以进一步提升其在结核病中的诊断能力。结论:应用肺泡灌洗液酶联免疫斑点检测技术进行临床活动性肺结核的诊断,因敏感性较高、阴性预测值较低且不易受到支气管结核或糖尿病等因素的影响,可以进一步提升肺结核患者的诊断能力,在结核病诊断中具有良好的临床应用价值。